Practica 1

EXTRACCIN Y ANLISIS ADN genmico de suelo

Introduccin
Extraccin de DNA
En general, dada su complejidad macromolecular, los cidos
nucleicos son difciles de separa de los componente de
membrana , protena residual o aadida (tales como las enzimas
de restriccin) y otras molculas solubles (polisacridos). Loa
mtodos drsticos alteran sus estructuras y sus caractersticas.
De ah que sean muchos mtodos suaves elaborados para
eliminar la impureza de las preparaciones , todos ellos basado en
las propiedades fsico-qumicas del acido nucleico. Para la
eliminacin de protenas asociadas se utilizan enzimas
proteolticas , como la proteinasa K

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Introduccin

El protocolo bsico
consiste en el
tratamiento del
homogeneado con
disolventes organicos
(fenol, cloroformo o
ambos)

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Introduccin
Purificacin de cidos nucleicos por precipitacin salina diferencial
Procedimiento alternativo al anterior , basado en las diferencias de solubilidad de
DNA y ARN en funcin de la concentracin de sales : Tanto en DNA como RNA
son solubles en disolucin salina concentrada , mientras que a baja
concentracin de sales solo es soluble en RNA

Para esta precipitacin salina se suele utilizar NaCl, pero puede

tambin emplearse acetato sdico saturado, en combinacin
con alcoholes orgnicos, conduciendo a resultados incluso
mejor que con fenol y cloroformo , sobre todo para cantidades
pequeas de DNA

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Introduccin
Recogida y conservacin de las muestras
Una vez separados y extrados, los cidos nucleicos
deben ser conservados adecuadamente. El precipitado
seco de cidos nucleicos o el ovillo de fibras de DNA
obtenidos
,
pueden
disolverse
en
disolucin
amortiguadora (alcalina , en el caso de DNA) y
conservarse a 4 C , o disolverse en agua y mantenerse
congelados
para
posteriores
manipulaciones
enzimticas. El DNA genmico en disolucin no se debe
congelar, para evitar la rotura de las molculas por las
fuerzas de cizalla provocadas al solidificarse el hielo y al
descongelarse. Por el contrario, el RNA
se puede
conservarse congelado a -70 C en disolucin acuosa,
cuidando de aadir un inhibidor de Rnasas.
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Introduccin
Electroforesis
Esta tcnica se basa en la capacidad de las macromolculas
cargadas para desplazarse en un campo elctrico , con velocidad
proporcional a su carga e inversamente proporcional a su
tamao. Las molculas de DNA poseen, al pH alcalino habitual,
una carga negativa uniforme por unidad de masa , lo que hace
que su movilidad hacia en nodo (+) solo venga determinada
por el tamao de la molcula (numero de pares de bases, si es
lineal). Debe destacarse que los cromosomas eucariotas son
demasiado grandes para ser identificadas por este tipo de
anlisis , por lo que comnmente se aplica sobre DNA
fragmentado con nucleasas

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Introduccin

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Introduccin
ADN genmico
Es el conjunto de ADN que comprende el genoma de un
organismo, es el ADN cromosmico nuclear que ha sido aislado
directamente de clulas o tejidos.
ADN plasmdico
Las cadenas de ADN plasmdico adoptan una conformacin tipo
doble hlice al igual que el ADN de los cromosomas , aunque se
encuentran fuera de los mismos. No contienen informacin
escencial, si no que confieren ventajas al hopedador en
condiciones de crecimiento determinadas.

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Objetivos
Objetivo general
Extraccin de ADN genmico de suelo
Objetivos especficos
Determinacin la calidad del material gentico extrado
mediante una electroforesis en gel de agarosa
Estimacin de la concentracin y pureza del mismo.

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Metodologa

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Fundamentos
Mtodo de extraccin y purificacin con CTAB
El protocolo del mtodo del bromuro de cetil-trimetil amonio
(CTAB) fue elaborado por Murray y Thompson en 1980. El
mtodo es adecuado para extraer y purificar ADN de vegetales y
alimentos derivados de vegetales y est especialmente indicado
para eliminar los polisacridos y los compuestos polifenlicos,
que, de otro modo, alteraran la pureza del ADN y, por tanto, su
calidad.

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Metodologa para la extraccin de ADN

genmico de suelo.

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Pesar 300-400 mg de suelo en un tubo centrfuga de

15 ml.
+9 ml de CTAB (65) - mezclar
Incubar durante 40 min (65) y Enfriar por 4-5 min.
+4.5 ml (cloroformo/isopropanol, 24:1)
Mezclar 5-10 min
Centrifugar 10 min a 3200 rpm (T amb)
Transferir la fase acuosa a tubo de 15 ml
+4.5 ml de cloroformo/isopropanol. Mezclar 5-10
min.
Centrifugar 10 min a 3200 rpm
Transferir a tubo de 15 ml con 30 L de RNAsa
Mezclar e Incubar por 30 min T amb.

Metodologa de extraccin con Fenol para

obtener ADN de alta pureza
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4

Colocar ADN en microtubo eppendorf de 2

ml con 1 ml de agua Mq.
Disolver toda una noche
Aadir 1 vol. De fenol/cloroformo 1:1
Centrifugar a 3200 rpm x 10 min
Transferir fase acuosa a tubo eppendorf
nuevo.
Extraer ADN con 1 ml de
cloroformo/octanol.
Centrifugar a 3200 rpmx 10 min.
Transferir fase acuosa a nuevo tubo
eppendorf de 2ml

Precipitacin con Etanol y Lavados de la

Pastilla
1

Precipitar ADN aadiendo 50L de NaCl 5M

+1 ml EtOH, mezclar por inversin
Centrifugar a 12000 rpm 1 min

Recuperar pastilla
+ 2 ml de solucin de lavado
Agitacin suave por 10-20 min

Centrifugar a 12000 rpm 1 min. Para recuperar

pastilla
Adicionar solucin de lavado 2 y dejar secar la
pastilla

Decantar solucin de lavado 2. Secar

pastilla.
+0.3-0.5 ml de TE al tubo eppendorf
Tapar y dejar disolver ADN a TA toda la
noche

Electroforesis en gel de agarosa

1

Pesar 1g de agarosa + Buffer TAE 1x a 100 ml

Fundir en horno de microondas + 5L de BrET
Depositar en carro con peine para gel

Solidificar en campana de extraccin.

Colocar en cmara de corrimiento con Buffer TAE
1x

5L de ADN + gota de Buffer de carga en cuadro

de parafilm
Mezclar y cargar en el gel

Conectar fuente de poder y correr gel a 70-90 V

Separacin partes del gel
Observar en Transiluminador con UV.

Fundamentos
Principios del mtodo del CTAB: lisis, extraccin y
precipitacin
Las clulas vegetales pueden lisarse con el detergente inico
bromuro de cetiltrimetil amonio (CTAB), que forma un complejo
insoluble con los cidos nucleicos en medio hiposalino. De ese
modo, los polisacridos, los compuestos fenlicos y los dems
contaminantes permanecen en el sobrenadante y pueden
eliminarse por lavado. El complejo de ADN se solubiliza
aumentando la concentracin salina y se precipita con etanol o
isopropanol.

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Fundamentos
Lisis de la membrana celular
La primera etapa de la extraccin del ADN es la rotura de la
membrana celular y nuclear, para lo cual la muestra
homogeneizada se trata primero con el tampn de extraccin,
que contiene EDTA, Tris-HCl y CTAB. Todas las membranas
biolgicas presentan la misma estructura general, integrada por
molculas de lpidos y de protenas, unidas por interacciones no
covalentes.

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Fundamentos
Extraccin

En esta etapa, se separan los complejos formados por los cidos

nucleicos y el CTAB de los polisacridos, los compuestos fenlicos, las
protenas y los dems lisados celulares disueltos en la solucin acuosa.
Es especialmente importante eliminar los polisacridos y los compuestos
fenlicos, pues pueden inhibir numerosas reacciones enzimticas. El
cloroformo desnaturaliza las protenas y facilita la separacin de las fases
acuosa y orgnica. La fase acuosa suele constituir la fase superior. La
extraccin con cloroformo se realizar dos o tres veces, con objeto de
eliminar por completo las impurezas de la capa acuosa. Para perfeccionar
la extraccin de los cidos nucleicos, puede retroextraerse la fase
orgnica con una solucin acuosa, que se aade a continuacin al
extracto anterior. Una vez purificados los complejos de cidos nucleicos,
puede procederse a la precipitacin, ltima etapa del procedimiento.

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Fundamentos
Precipitacin
En esta ltima etapa se separan los cidos nucleicos del
detergente, para lo cual la solucin acuosa se trata primero con
una solucin de precipitacin compuesta por una mezcla de
CTAB y NaCl en concentracin elevada (NaCl > 0,8 M). Una alta
concentracin salina es necesaria para que se forme un
precipitado de cidos nucleicos. Puede ser preferible emplear
acetato de sodio en lugar de NaCl por su capacidad tampn. En
estas condiciones, el detergente, que es ms soluble en alcohol
que en agua, puede eliminarse por lavado, mientras que los
cidos nucleicos precipitan. El posterior tratamiento con etanol al
70 % permite una mayor purificacin o elucin de los cidos
nucleicos de la sal residual.
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Fundamentos

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Fundamentos
Cuantificacin del ADN mediante espectrofotometra
El ADN, el ARN, los oligonucletidos e incluso los mononucletidos pueden
cuantificarse directamente en soluciones acuosas, en forma diluida o sin diluir,
midiendo la absorbancia A (o densidad ptica, DO) de luz ultravioleta (tambin puede
hacerse en el intervalo visible). Si la muestra es pura, es decir, no contiene cantidades
significativas de contaminantes como protenas, fenol o agarosa, la medicin
espectrofotomtrica de la irradiacin ultravioleta absorbida por las bases es sencilla y
exacta.
La concentracin de cidos nucleicos suele determinarse midiendo a 260 nm y
comparando con un blanco. La interferencia de contaminantes puede determinarse
calculando un cociente. Dado que las protenas absorben a 280 nm, se emplea el
cociente A260/A280 para calcular la pureza de los cidos nucleicos
Cuando la cantidad disponible de cidos nucleicos es escasa, puede emplearse el
mtodo de la placa de agarosa con bromuro de etidio. Permite calcular la cantidad de
cidos nucleicos a partir de la intensidad de la fluorescencia emitida por el bromuro de
etidio irradiado con luz UV, comparndola con unos patrones de concentracin.

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Resultados y anlisis de resultados

A) Discute los resultados obtenidos en tu prctica:
Obtencin de ADN
Electroforesis en gel (FOTO GEL con ubicacin de tu carril de
corrimiento)
Espectrofotometra (Concentracin y pureza del ADN)

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Anlisis de Resultados.
Se
obtuvo una absorbancia a 260 nm de 0.310, por lo que la
concentracin de ADN obtenida es:

Sin embargo ese valor no representa la concentracin de ADN

puro, debido a interferencia proteica en la densidad ptica de la
muestra.

Relacin de Absorbancia 260/280 nm

Un ADN de pureza ptima se encuentra entre 1.8 y 2.0
La relacin de nuestra muestra es 1.35, lo que indica prioritariamente que hay
presencia de protenas, por lo que es conveniente realizar un nuevo proceso de
extraccin.
Aunque un pH cido puede modificar el resultado, solo disminuye entre 0.2 a 0.3
unidades el ndice. Por lo que se descarta esta posibilidad.
La composicin de los nucletidos libres tambin es capaz de modificar el ndice.

Se sospecha que la principal causa de la baja pureza en la muestra

es la presencia de protenas debido a una mala separacin de la
muestra de ADN.
Tambin es probable que el lavado de la muestra no retir todos
los contaminantes.
Adems un tiempo de procesamiento prolongado, y no realizar el
procedimiento en un rea estril representa un incremento en la
posibilidad de cometer errores durante la extraccin de ADN.

Anlisis de resultados obtenidos en la

electroforesis
No se logr obtener bandas definidas en la prueba de
electroforesis, se aprecia un efecto Smear en el gel.
Lo que podra indicar una posible contaminacin de la muestra
por nucleasas y la posible degradacin del ADN.
Si el mtodo hubiese funcionado correctamente, se hubiesen
presentado bandas bien definidas y de grosor considerable,
pues se manej ADN genmico, el cual migra ms lentamente
debido a su alto peso molecular.

Resultados y anlisis de resultados

B) Elabore un dibujo de la cmara de electroforesis donde
muestras el corrimiento de tu gel y las caractersticas de la
corrida.

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Foto electroforesis obtenida por el

transluminador
DNA genmico

DNA genmico

Material
gentico de
bajo peso
molecular

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Conclusiones
La extraccin de ADN debe realizarse en un espacio con las
condiciones que asegure la esterilidad del medio y con las
medidas de seguridad adecuadas (microfiltros, cubrebocas,
guantes, sin corrientes de aire, etc.)
El proceso se tiene que hacer sin distracciones y asegurando el
tiempo mnimo entre cada operacin para evitar la
contaminacin y la degradacin.
El lavado de la muestra es parte crucial este procedimiento
debera de repetirse bajo condiciones estndar tantas veces
fuera necesario para asegurar que la muestra quede libre de
protenas compuestos fenlicos, polisacridos , y dems
material que pueda participar en la degradacin de la muestra.

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La colocacin de la muestra d ADN en el posillo se debe de

realizar con extrema pericia para evitar que se quede en el
fondo y no sea capaz de salir de el pero tambin que no quede
fuera del pozo y se disperse.
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Conclusiones
La electroforesis en gel es una tcnica de suma importancia en
la biotecnologa ambiental ya que nos permite conocer el la
cantidad de pares de bases de la muestra.
La calidad del ADN y su grado de pureza se ven directamente
afectados por la calidad del proceso de extraccin de ADN.
La cantidad total de AND en la muestra depende de dos
factores principalmente e primero la extraccin como se
menciono anteriormente y en segundo lugar las caractersticas
fisicoqumicas del suelo donde se tomo la muestra ya que
pueden contribuir a su degradacin.

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Bibliografa
Hupfer, C., Hotzel, H., Sachse, K. y Engel, K.H. (1998). Detection of the
genetic modification in heat-treated products of Bt maize by polymerase
chain reaction.
Manual de laboratorio de biotecnologia ambiental
Luque , Herraez. Biologa molecular e ingeniera gentica (2008)
ELSEVIER. Madrid , Espaa

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