HPLC

Mantenimiento y Gua de
Problemas a resolver.

DIAGNOSTICOS

Bomba

Principales Problemas

Fugas:

Conexin de tubera floja

Frula y conector defectuoso
Cuerda barrida de conector
Filtro de alta presin defectuoso
Damper defectuoso
Vlvula Check floja

Ruido:

Burbujas en cmara de pistn

Vlvula Check de entrada defectuosa
Falta de lquido

Funcionamiento:

Presin excesiva
Lecturas erraticas de presin
Presin Cero (No flujo)
Flujo deficiente

Problemas del Sistema

Marcas de pico en lnea base relacionadas al

movimiento del pistn
Ruido en lnea base no relacionado al
movimiento del pistn
Tiempos de retencin no reproducibles

Miscelaneos

Bomba muerta
Acumulacin de sales en pistn

DETECTOR

Principales Problemas

Marcas de Pico en Lnea Base

Ruido Excesivo en Lnea Base
Deriva Excesiva de Lnea Base
Correccin de Zero muy grande
Lmpara Deuterio no enciende
Prdida de comunicacin con la PC
No datos
Icono de detector desactivado en configuracin
Detector no calibra

Automuestrador

Problemas Principales

No inyecta muestra (Con aguja en buen estado)

Mala reproducibilidad
Contaminacin Contnua
Excesivo carry over

Mantenimiento

Mantenimiento Bomba
Reconocimiento de hardware

Mantenimiento Bomba
Cambio de check de salida

Mantenimiento Bomba
Cambio de Check de Entrada

Mantenimiento Bomba
Cambio de Filtro de Check de Salida

Mantenimiento Bomba
Reemplazo de Filtro de Alta Presin

Mantenimiento Bomba
Reemplazo de Filtro de Lnea

Mantenimiento Bomba
Cambio de Pistn

Mantenimiento Bomba
Cambio de Sellos

Mantenimiento Bomba
Purga de Bombas

Mantenimiento Detector
Ensamble Detector 166

Mantenimiento Detector
Remover/Reemplazar/Limpiar Celda de Flujo (Det. 166)

Mantenimiento Detector
Removiendo el Ensamble de la Lmpara

Mantenimiento Detector
Removiendo Ensamble del Monocromador

Mantenimiento Detector
Removiendo/Limpiando Celda de Flujo (Det. 168)

Mantenimiento Detector
Reemplazando Lmpara de Deuterio (Det. 168)

Mantenimiento Automuestrador
Reconocimiento de Dispositivos

Mantenimiento Automuestrador
Cambiando la Jeringa de Inyeccin

Mantenimiento Automuestrador
Reemplazo de Aguja de Aire

Mantenimiento Automuestrador
Reemplazo de Aguja de Muestra

SERVICIOS QUE OFRECEMOS...

Mantenimiento &
Calibracin

Procedimientos
Escritos

Validacin de
Mtodos

Entrenamiento

GLP
CGMP

Validacin de
Software

Seguridad de
Datos

Preguntas y Respuestas...

1.No hay picos / picos muy pequeos

Posible Causa

Solucin/Comentarios

1. Lmpara apagada detector

1. Encender

Lampara
2. Flojo/Quebrado cable entre el detector
conecciones electricas y cables.
3. No flujo de fase movil.
siguiente No Flujo
4. No muestra/muestra deteriorada.
los viales tienen suficiente
5. Parametros muy altos en escala detector
no tienen burbujas. Evalue

2. Checar
3. Ver prolema
4. Asegurese que
muestra y que
el desempeo

del sistema con estandar

fresco, para
comfirmar si la muestra es la
fuente del
problema.
5. Checar
atenuacion o ganacias. Checar
estatus de la
lampara y el autozero

2.Sin flujo

1.
2.
3.
4.

Bomba apagada
Flujo interrumpido/obstrudo
Fuga
Aire atrapado en la cabeza de la bomba (revelado por
fluctuoaciones en la presin)

1.
2.
3.
4.
5.

Encender la bomba
Checar el nivel de la fase mvil en el reservorio. Checar el
flujo atravs del sistema; examinar el loop de muestra por
obstruccin o aire. Asegrese que los componentes de la fase
mvil son visibles y la fse mvil est adecuadamente
desgasificada
Checar el sistema en el sistema conectores flojos. Checar en
la bomba fugas, sales, ruidos inusuales. Cambie los sellos de
ser necesario.
Desconecte el tubing y la columna. Cheque el flujo. Purgue la
bomba a un flujo de 5-10ml, purgue el sistema, cada cabeza
separadamente. Afloje las valvulas checks para que escape el
aire . Si el problema persite purgue el sistema con Metanol o
isopropanol.

3.No hay presin/presin ms baja de lo usual

1.
2.
3.
4.
5.
6.

Fuga
Flujo de fase movil interrumpido/obstruido
Aire atrapado en la cabeza de la bomba.
Fuga en conector a la entrada de la columna.
Aire atrapada en alguna parte del sistema.
Sello de la bomba en mal estado, causando fugas alrededor de
la cabeza.

1.
2.

3.
4.
5.
6.

Cheque el sistema conectores flojos. Cheque la bomba por

fugas, sales, ruidos inusuales. Cambie los sellos de ser
necesario.
Cheque el nivel de la fase mvil en los reservorios. Cheque
flujo atravs del sistema. Examine el Loop por obstruccin o
aire. Asegurese que los componentes de la fase movil son
miscibles y estan propiamente desgasificados.
Purgue el sistema sin columna y afloje las valvulas checks de
ser necesario para que saquen el aire atrapado.
Reconecte la columna y ponga el flujo al doble, si la presion
permanece baja, cheque fugas en los conectores de entrada y
salida de la columna
Desconecte la columna purge el sistema con metanol y/o
isopropanol.
Reemplace sellos si el problema persiste, re-emplace pistones
y sellos

4.Presin ms alta de lo usual

1.
2.

Problema en la bomba, inyector, en filtro de lnea o tubing.

Guardacolumna obstruda o columna analtica

1.

2.

Remueva la guardacolumna y la columna del sistema.

Reemplace con uniones y un tubing largo para reconectar el
inyector al detector. Corra la bomba de 2-5 Ml/min. Si la
presin es mnima, ver la causa 2.
Si no, aislar la causa
eliminando sistemticamente los componentes iniciando con
detector, filtro en lnea, trabajando hacia atrs hacia la bomba.
reemplace filtro en la bomba si est presente.
Remueva guardacolumna y cheque presin. Si la columna
est obstruda, dele vuelta y enjuague la columna,
desconectada del conector.
Si el problema persiste, la
columna puede estar tapada con contaminantes fuertemente
retenidos. Use un procedimiento adecuado de restauracin.
Si el problema persiste, cambie los frits o reemplace la
columna.

5.Tiempos de retencin Variables

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Fuga
Cambio en composicin de fase mvil (pequeos cambios
pueden dar grandes cambios en tiempos de retencin)
Aire atrapado en la bomba (Tiempos de retencin incrementan
o decrementan en tiempos aleatorios)
Fluctuaciones en la temperatura de la columna (especialmente
evidente en sistemas de intercambio de iones)
Sobrecarga de la columna. (Tiempos de retencin usualmente
decrecen cuando la masa de soluto inyectada excede la
capacidad de la columna
Incompatibilidad del solvente de la muestra con la fase mvil.
Problema de columna (no es una causa comn de tiempos de
retencin errticos. De acuerdo a la edad de la columna, los
tiempos de retencin gradualmente decrecen).

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Revise que el sistema no tenga conectores flojos. Revise

fugas en la bomba, sales, ruidos inusuales. Cambie los sellos
de la bomba si es necesario
Revise la preparacin de la fase mvil. Si la fase mvil es
mezclada usando vlvulas proporcionadoras, mezclela a mano
y suminstrela en un reservorio.
Purgue el aire de la cabeza de la bomba o vlvulas check .
Cambie los sellos de la bomba si es necesario. Asegrese que
la fase mvil est desgasificada
Use horno de columna (altas temperaturas incrementan la
eficiencia de la columna. Para resultados ptimos, caliente el
eluyente antes de introducirlo a la columna).
Inyecte volmenes pequeos (e.g. 10uL vs 100uL) o inyecte el
mismo volumen despus de 1:10 1:100 dilusiones de
muestra.
Ajuste solvente. Siempre que sea posible, inyecte muestras
en fase mvil
Substituya la columna por una nueva del mismo tipo para
confirmar si la columna es la causa. Descarte la columna vieja
si los procedimientos de restauracin fallan.

6.Prdida de resolucin

1.
2.

Fase mvil contaminada / deteriorada (causando cambios en

tiempo de retencin y/o selectividad ).
Guardacolumna o columna obstruida

1.
2.

Prepare fase mvil fresca

Remueva guardacolumna y repita el anlisis. Si la columna
analtica est obstruda dele vuelta y enjuague, si el problema
persiste, la columna debe estar tapada con contaminantes
fuertemente retenidos. Use el procedimiento adecuado de
restauracin. Si el problema persiste, cambie los frits o
reemplace la columna.

7.Picos partidos

1.
2.
3.
4.

Contaminacin en precolumna o columna

Frit parcialmente bloqueado
Pequeo espacio muerto a la entrada de la columna
Solvente de la muestra incompatible con la fase mvil

1.

2.
3.
4.

Remover columna y repetir el anlisis. Si la columna analtica

est obstruda dele vuelta y enjuguela, si el problema
persiste, la columna puede estar tapada con contaminantes
fuertemente retenidos. Use el procedimiento adecuado de
restauracin. Si el problema persiste, probablemente los frits
estn parcialmente tapados, cambie frits o reemplace la
columna.
Reemplace frits
Trate de re-empacar el espacio muerto con una pelcula de
partculas de la misma fase de la columna. Contine usando la
columna con el flujo en direccin contraria.
Ajuste solvente. Siempre que sea posible, inyecte muestra en
fase mvil.

8.Picos coleados en inyecciones iniciales o ltimas

1.
2.
3.

Muestra reaccionando con sitios activos.

Fase mvil con pH incorrecto
Tipo de columna incorrecta

1. verificar el desempeo de la columna con un estndar y

luego con la mezcla. Si los resultados de la mezcal son
correctos agregar el agente completando la base o modificando
el cido.

2.Ajustar el pH. Los compuestos bsicos de pH bajo

generalmente registran picos mas simtricos.

3. Intentar con otro tipo de columna.

4. observar el problema 7.

5. Los picos pueden tener cola cuando la muestra es inyectada

en un solvente mas fuerte que la fase mvil. Disolver la muestra
en fase mvil

9.Picos Coleados

Columna Analtica contaminada o fuera de uso

Fase Mvil contaminada
Interferencia en la muestra

1. Desmontar la pre columna (si est puesta) y repetir el

anlisis. Reemplazar la pre columna si es necesario. Si la
columna analtica es la fuente del problema, usar el
procedimiento adecuado de restauracin. Si el problema
persiste reemplazar la columna

2. Verificar la elaboracin de la fase mvil

3. Verificar el desempeo de la columna con estndares.

10.Picos Frontales

Columna sobre cargada.

Solvente de la muestra incompatible con la fase mvil
Hombro o movimiento de la linea base antes del pico principal
causado probablemente por otro componente en la muestra.

1. Inyectar un pequeo volumen (10l vs.100l). Diluir la

muestra1:10 o 1:100 duplicar en caso de masa sobre cargada
2. Ajustar el Solvente. Cuando sea posible inyectar muestras en
fase mvil. Purgue la columna consolidada con 50 veces el
volumen de la columna de acetato de etilo a un flujo 2 o 3 veces
mayor que el flujo estndar, despus con un solvente de
polaridad intermedia previa al anlisis
3. Incrementar la eficiencia o cambiar la seleccin para mejorar
la resolucin. Intentar con otro tipo de columna si es necesario

11. Picos Redondeados

Detector operando fuera del rango dinmico lineal

Ganancia baja del registrador
Columna sobre cargada
Interaccin de muestra y columna
Tiempo del registrador o detector constantemente altos

1. Reducir el volumen o concentracin de la muestra

2. Ajustar la ganancia
3. Inyectar un pequeo volumen (10l vs.100l). Diluir la
muestra 1:10 o 1:100
4. Cambiar la fuerza inica del buffer, el pH, o la composicin
de la fase mvil. Si es necesario cambiar el tipo de columna o
bien aumentar la temperatura de la columna.
5. Aumentar los valores del Data Rate hasta el valor para el cual
no se observa ninguna mejora.

12. Ruido en la lnea base

Variacin en la temperatura de la columna

Fase mvil no homognea
Aire o algn contaminante en la celda del detector
Tapn despus de la lnea de salida del detector
Problema con la mezcla de fase mvil o variacin en el flujo
Estabilizacin lenta de la columna en especial cuando cambia
la fase mvil
Fase mvil contaminada, deteriorada o preparada con
compuestos qumicos de pureza inadecuada.

1.

Controlar la temperatura de la columna y fase mvil. Usar un

controlador de temperatura antes del detector.

2.

Usar solventes grado HPLC, aditivos y sales de alta pureza.

Desgasificar la fase mvil antes de su uso .Burbujear con
Helio durante su uso

3.

Dejar fluir metanol u otro solvente fuerte a travs de la celda. Si

es necesario limpiar la celda con 1N HNO3 nunca con HCl y
nunca usar cido ntrico concentrado en tuberas PEEK

4.

Desconectar o reemplazar la lnea. Hacer referencia al detector

manual para reemplazar ventana

5.

Corregir la composicin / Flujo. Para evitar problemas

monitorear continuamente la composicin y el flujo

6.

Dejar fluir por la columna un solvente de fuerza intermedia un

volumen de 10-20 columnas con la nueva fase mvil antes del
anlisis.

7.

Verificar la elaboracin de la fase mvil

8.

Usar una pre columna. Si es necesario purgar la columna con

un solvente fuerte entre inyecciones o mientras dure el anlisis

9.

Cambiar la longitud de onda para la absorbancia mxima de UV

13.Ruido en la Lnea Base (Regular)

1.

Aire en la fase mvil, en la celda del detector, o en la bomba

2.

Pulsaciones en la bomba

3.
4.
5.
6.

Mezcla incompleta de la fase mvil

Efecto de temperatura (columna a alta temperatura y detector
con baja temperatura)
Otro equipo conectado a la misma lnea

1.

Desgasificar la fase mvil ,purgar el sistema para remover aire

desde la celda del detector o la bomba.

2.

Incorporar un damper al sistema

3.

Mezclar la fase mvil con la mano o usar un solvente menos

viscoso

4.

Agregar un intercambiador de calor

5.

Aislar el HPLC, detector, registrador para determinar si la

fuente del error es externo. Corregir si es necesario.

6.

Verificar que el sistema no tenga fugas, sales, ruidos

inusuales. Cambiarlos sellos de las bombas si es necesario

Fugas

14. Ruido en la lnea base (irregular)

1.

Fugas

2.

Fase mvil deteriorada, contaminada o preparada con

compuestos de baja pureza

3.

Fallas electrnicas en el detector

4.

Aire atrapado en el sistema

5.

Burbujas en el detector

6.

Celda contaminada (incluso pequeas cantidades de

contaminante pueden causar ruido)

7.

Lmpara del detector dbil

8.

Fuga de slice en la columna o el material de empaque

1.

Verificar conexiones flojas, fugas, sales o ruidos inusuales.

Cambiar los sellos de la bomba si es necesario

2.

Verificar como se elaboro la fase mvil

3.

Aislar el detector y el registrador electronicamente.

4.

Purgar el sistema con un solvente fuerte.

5.

Purgar el detector, instalar regulador de contra presin a la

salida del detector

6.

Limpiar la celda

7.

Reemplazar lmpara

8.

Reemplazar la columna y limpiar el sistema

15. Picos Anchos

1.

Cambio de la composicin de fase mvil

1.

Preparar nueva fase mvil

2.

Flujo de la fase mvil muy baja

2.

Ajuste el flujo

3.

Fugas especialmente entre la columna y el detector

3.

4.

Parmetros incorrectos del detector

Verificar que no existan conexiones flojas en el sistema,

fugas en la bomba, existencia de sales o ruidos raros.
Cambiar los sellos de la bomba si es necesario

4.

Ajustar los parmetros

5.

Inyectar un Volumen menor (10l vs. 100l o una

disolucin de muestra de 1:10 y 1:100. Reducir el tiempo
de respuesta o usar una celda mas pequea. Usar tubera
de dimetro mas pequeo (0.007-0.010)

5.

Efectos extra de la columna

1.
2.
3.
4.

Columna sobrecargada
Tiempos y volmenes muy altos causados por el detector
Tubera entre columna y detector muy grandes o ID muy largo
Registrador responsable de tiempos muy altos

6.

Concentracin del buffer muy baja

6.

Incrementar la concentracin

7.

Pre columna contaminada o fuera de uso

7.

Reemplazar la pre columna

8.

Columna contaminada o fuera de uso

8.

9.

Vaci en la entrada de la columna

Reemplazar la columna por una del mismo tipo. Si la

nueva columna no proporciona picos Angostos . Purgar la
vieja columna, despus repetir la prueba.

10.

El pico representa dos o mas picos con resolucin pobre

9.

Reemplazar la columna o abrir la lnea de entrada y llenar

el vaco.

11.

La temperatura de la columna es muy baja

10.

Cambiar el tipo de columna o mejorar la sepatracin

11.

Incrementar la temperatura, no exeder los 75 C a menos

de que las temperaturas mas altas sean aceptables para el
fabricante de la columna

16. Variacin en la altura de los picos

1.

Uno o mas componentes de la muestra estn deteriorados o

ha cambiado la actividad de la columna

2.

Fugas, especialmente entre el puerto de inyeccin y la entrada

de la columna (la retencin podra cambiar tambin)

3.

Volumen de la muestra inconsistente

4.

Variacin en los parmetros del detector y del registrador

5.

Lmpara del detector dbil.

6.

Contaminacin en la celda

1.

Usar una muestra fresca para confirmar si sta es la fuente del

problema. Si algunos o todos los picos permanecen ms
pequeo de lo esperado, reemplazar la columna. Si la nueva
columna mejora el anlisis reinstalar la vieja columna,
siguiendo el procedimiento adecuado. Si el desempeo no
mejora descartar la vieja columna

2.

Revisar conexiones flojas, fugas, sales, ruidos inusuales,

cambiar los sellos de la bomba si es necesario.

3.

Asegurarse de que las muestras son consistentes. Para un

loop de volumen fijo use 2 o 3 veces el volumen del loop para
asegurarse de que ste est totalmente lleno. Asegurarse de
que los viales del muestreador contienen suficiente muestra y
no burbujas de aire. Verificar que no exista aire en la jeringa.
En sistemas con pasos de lavado o purgaasegurar que la
solucin de enjuague no precipite los componentes de la
muestra

4.

Verificar los parmetros

5.

Reemplazar la lmpara

6.

Limpiar la celda

17. Variacin de Selectividad

1.

Incrementar o decrementar la fuerza inica del solvente, pH, o

concentracin aditiva (especialmente afecta solutos inicos)

2.

Cambio de Columna, la nueva columna tiene una selectividad

diferente a la de la vieja columna.

3.

Muestra inyectada en un solvente incorrecto o en cantidad

excesiva (100-200 l) de solvente fuerte

4.

1.

Verificar la elaboracin de la fase mvil

2.

Confirmar la identidad del empaque de la columna. Para

anlisis reproducible use el mismo tipo de columna. Establecer
si el cambio tomo lugar gradualmente. Si es as la fase
estacionaria se pudo haber disuelto. La actividad de la
columna pudo haber cambiado o la columna est contaminada

3.

Ajustar solvente. Siempre que sae posible inyecte muestra en

fase mvil

4.

Ajustar temperatura. Si es necesario usar un horno de

temperatura para mantener la temperatura constante

Variacin de la temperatura de la columna

18. Picos Negativos

1.

Conexin intercambiada del registrador.

1.

Verificar polaridad de la conexin del registrador

2.

ndice de refraccin del soluto menor que el de la fase mvil

(Detector RI)

2.

Usar fase mvil con menor ndice de refraccin o intercambie

las conexiones del registrador

3.

La muestra del solvente y la fase mvil difieren en gran medida

en composicin.

3.

Ajustar o cambiar el solvente de la muestra. Diluir muestra con

fase mvil siempre que sea posible

4.

La fase mvil tiene mayor absorbancia que los componentes

de la muestra en la regin ultravioleta

4.

Cambiar la polaridad del registrador cuando use deteccin UV

o Cambie la longitud de onda o usar fase mvil que no absorba
la longitud de onda elegida

19. Picos Fantasma

1.

Contaminacin en el inyector o columna

2.

Pico de elusin tardo (Usualmente ancho) presente en la

muestra

1.

Enjuagar el inyector entre anlisis. Si es necesario correr

solvente fuerte a travs de la columna para remover las
elusiones tardas. Incluir un paso de lavado al final de los
anlisis de gradiente, para remover, compuestos retenidos
fuertemente.

2.

Verificar la preparacin de la muestra. Incluya un paso de

gradiente para expulsar el componente rapidamente