Injertos Tecnicas Modernas

Criopreservacin de clulas madre de sangre perifrica.
Introduccin.
Criopreservacin:
Tcnicas para conservar tejidos vivos a bajas temperaturas.
Transplante de clulas madre de sangre perifrica

(PBSCT):
Transplante autlogo o alognico de clulas madre
pluripotenciales obtenidas de sangre perifrica (no de mdula
sea).
Copyright Trevio-Quintanilla LE, Trevio-Rangel L, Trevio-Salinas MB, Uriegas-Alejandro A, Valdez-Flores JL, Valdez-Leza CE, ValdezRamrez MA, Vzquez-Ayala JA, Vzquez-Cisneros, GC. Monterrey, NL. Mxico. Julio de 1998.
Antecedentes.
1949. Glicerol como crioprotector. (Polge et al.).
1951. Clulas madre en sangre perifrica en ratones
(PBSC) (Brecher et al).
1964. PBSC en humanos (Freireich et al).
1977. Primer PBSCT en perros (Cavins et al).
1986. Primer PBSCT y criopreservacin en humanos
(Kessinger et al).
1993. Primer PBSCT humano con seleccin de
clulas CD34+ (Shpall et al).
2
Transplante de mdula sea (BMT) vs. PBSCT.

BMT
PBSCT
Paciente
Paciente internado.
internado.
Paciente
Paciente no
no internado.
internado.
Requiere
Requiere anestesia.
anestesia.
Sin
Sin anestesia.
anestesia.
Reconstitucin
Reconstitucin inmune
inmune aa 11 ao.
ao.
Reconstitucin
Reconstitucin inmune
inmune temprana.
temprana.
10
10 veces
veces ms
ms clulas
clulas madre.
madre.
10
10 veces
veces ms
ms linfocitos
linfocitos T.
T.
Amplia
Amplia experiencia.
experiencia.
Poca
Poca experiencia.
experiencia.
Ventajas del PBSCT.

No hay necesidad de hospitalizar al donador de
PBSC.
No precisa ningn tipo de anestesia.
Rpida recuperacin hematopoytica en el receptor.
Buen recurso para pacientes en quienes es difcil
obtener mdula sea.
Fases del PBSCT.

Afresis.
Seleccin celular.
Movilizacin.
Criopreservacin.
Mieloestimulacin.
Infusin.
5
Quimioterapia
y/o radioterapia.
Dilucin
y lavado.
Descongelamiento.
Movilizacin de clulas madre a sangre

perifrica.
La administracin de GM-CSF aumenta a ms de
30x106 el nmero de GM-CFU.
La administracin de quimioterapia por 4 o 5 das
aumenta 14 veces los valores basales de GM-CFU.
3x109/kg de GM-CSF.
La cantidad ptima de clulas mononucleares es de 67x108/kg de peso.
Recoleccin de PBSC.
Se inicia cuando las clulas CD34+ son el 0.1% de las
clulas nucleadas.
Obtencin por afresis de 60 ml/min por 4 horas.
Se prepara en 5 das con un mnimo de 15x106 clulas
CD34+/kg de peso.
La mayor parte de la recoleccin es en la ltima hora.
5 clulas CD34+/l de sangre perifrica.
Procesamiento de PBSC.
Justificacin. (Mdula sea vs sangre perifrica).
Heterogeneidad entre la poblacin de clulas madre

en mdula y sangre perifrica.
Mayor nmero de clulas maduras en sangre
perifrica.
Menor nmero de clulas madre (<0.1%) en sangre
perifrica.
En las neoplasias, la presencia de invasin medular.
Mtodos.
Afresis.
Gradientes de separacin por densidad.
Seleccin de clulas CD34+.
Eliminacin de linfocitos y granulocitos.
Expansin ex vivo.
Problemas del procesamiento.
Destruccin de clulas diferenciadas (eritrocitos,

granulocitos, etc).
Criopreservacin imperfecta por la presencia de
clulas maduras.
Toxicidad en la infusin por citocinas y componentes
intracelulares.
10
Lesin por congelacin.

Causas de dao celular por congelacin.
Dao mecnico por formacin de hielo intra- y

extracelular.
Dao mecnico por expansin trmica.
Hiperosmolaridad extracelular y deshidratacin.
Cambios en el pH.
Desnaturalizacin de protenas.
11
Teora de la congelacin.
Propiedad coligativa de los solutos.
Solucin eutctica
(con menor punto de
congelacin).
0C
0C
Solucin superenfriada.
Centros de nucleacin
de hielo.
0C
0C
Solucin eutctica con

ms solutos segregados
(an con menor punto
de congelacin).
12

Dao mecnico.
de hielo intracelulares.
Clula
sangunea.
Clula sangunea
destruida.
de hielo.
13

Dao osmtico (deshidratacin).
Espacio extracelular
normosmtico.
Clula sangunea
normosmolar.
Clula sangunea
deshidratada.
Salida de agua
intracelular.
de hielo.
hiperosmolal.
14
Crioproteccin.
Mecanismo coligativo.
normosmtico.
Molcula de
DMSO.
Clula
sangunea.
Clula sangunea
con poco estrs
osmtico.
de hielo.
ligeramente hiperosmolal.
15
Crioproteccin.
Mecanismo de la envoltura cristalina.
normosmtico.
Molcula de
HES.
Clula
sangunea.
Envoltura cristalina
de HES.
de hielo.
Clula sangunea con

ligera deshidratacin.
hiperosmolal.
16
Crioprotectores.
Propiedades.
No debe ser txico para las clulas a las

concentraciones requeridas para la criopreservacin.
La concentracin de los crioprotectores depender de
la tolerancia de la clula al crioprotector.
Debe de ser eliminable antes de la infusin o inocuo
para el paciente.
17
Crioprotectores.
Las substancias crioprotectoras ms utilizadas son:
Glicerol.
DMSO (dimetilsulfxido).
Soluciones salino/glucosadas.
Protenas.
HES (hidroxietilalmidn).
18
Crioprotectores.
Glicerol y dimetilsulfxido (DMSO).
Crioprotectores coligativos previenen la deshidratacin

y disminuyendo la cantidad de agua absorbida por los
cristales de hielo.
El DMSO es ligeramente txico.
Actualmente se utiliza DMSO al 5% con HES al 6% y
albmina srica humana al 4%.
19
Crioprotectores.
Soluciones salino/glucosadas.
Glucosa, manitol y sorbitol a concentraciones mayores

de 0.1 molar
Estabilizan la membrana celular durante la
congelacin o deshidratacin.
La glucosa protege contra la citotoxicidad celular a
altas concentraciones de DMSO.
20
Crioprotectores.
Protenas.
Aumentan la supervivencia de las clulas cuando se

agregan a la solucin crioprotectora.
Modifican la viscosidad y la temperatura de la
transicin hialina de la solucin crioprotectora.
La fuente puede ser autloga.
21
Soluciones crioprotectoras.
Hidroxietilalmidn (HES).
Sustancia polimrica con cadenas de diferentes pesos

moleculares que no penetra la clula de forma libre.
Protege a la clula formando una capa viscosa y
hialina que retarda el movimiento de agua.
22
Almacenamiento.
Congeladores mecnicos.
-120C a -86C.
Congelador de nitrgeno lquido.

-196C a -142C.
23
Almacenamiento.
Almacenamiento de clulas criopreservadas es en
bolsas de plstico de PVC/poliolefin y en frascos de
polietileno.
Las bolsas se colocan en cassettes de aluminio.
24
Velocidad de congelacin controlada.
DMSO al 10 %.
Concentracin celular 50x106/ml.
Velocidad inicial de -1C/min.
En -40C incrementar a -10C/min.
En -80C colocar en la fase gaseosa de nitrgeno
lquido hasta -146C.
25
Velocidad de congelacin no controlada.

DMSO al 5 % con HES al 6 %.
Concentracin celular de 109/ml.
Colocan en bolsas de almacenamiento en un
congelador mecnico a -80C.
En los -80C incrementar a 10-16C/min la velocidad
hasta -146C.
Almacenar en la fase gaseosa de nitrgeno lquido.
26
Velocidad de congelacin.
Controlada vs no controlada.
50
50
Nitrgeno (gas)
Nitrgeno (gas)
Congelacin con
velocidad controlada.
Nitrgeno (lquido)
Nitrgeno (lquido)
Congelador mecnico
Congelador mecnico
Temp.(C).
(C).
Temp.
00
-50
-50
-80C
-80C
Tolerancia de
la congelacin
no controlada.
-100
-100
-150
-150
-200
-200
00
-150C
-150C
-196C
-196C
10
10
20
20
30
30
40
40
50
50
60
60
70
70
80
80
Tiempo
Tiempo(min).
(min).
27
90
90
Ventajas de la congelacin no controlada.

Menor costo.
Menor tiempo tcnico.
El HES previene la lisis de granulocitos durante el
descongelamiento.
Usando DMSO al 5% disminuyen las reacciones
txicas durante la infusin.
Sencillo.
Menos espacio en el congelador.
28
Descongelamiento.
Descongelamiento rpido.
Velocidad >100C/min a 37C en bao Mara.
Se tiene mejor tasa de supervivencia celular con

descongelamiento rpido (>100C/min) que con
descongelamiento lento (<5C/min).
29
Efectos asociados a la infusin de PBSC.

100
100
90
90
92%
92%
77%
77%
80
80
(%) )
FFrerec cuueennc ciaia(%
70
70
71%
71%
67%
67%
65%
65%
64%
64%
60
60
61%
61%
50
50
43%
43%
43%
43%
40
40
39%
39%
36%
36%
16%
16%
15%
15%
14%
14%
^ ^c crereaat.t.s sr.r.
CCeefafaleleaa
20
20
rizac ciinn
RRuubbooriza
30
30
rreaa
DDiaiarre
Tos
Tos
ilirrubb. .s sr.r.
^ ^bbilirru
Taquuipipnneeaa
Taq
ito
VVmmito
fros s
EEs sc caalolofro
FFieiebbrere
^ ^TTAA
Taquuicicaardrdiaia
Taq
30
NNaas seeaas s
0
0
ria
HHeemmoogglolobbininuuria
10
10
Efectos asociados a la infusin de PBSC.

Los efectos colaterales de la infusin de PBSC se
minimizan reduciendo el volumen total y las clulas
rojas infundidas.
Los mtodos de seleccin celular disminuyen los
efectos colaterales y mejoran la velocidad de
respuesta del injerto.
31
Control de calidad de la criopreservacin.

Valoracin in vitro.
Conteo (citometra) (tasas de recuperacin de clulas

mononucleares, CD34+, eritrocitos y PMN).
Ensayos metablicos.
Prueba de viabilidad por exclusin de tincin (con azul
de trpano o yoduro de propidio).
Cultivo de CFU-GM (con dilucin seriada de DMSO y adicin
de sorbitol).
32
Indicaciones.
Usos del PBSCT.
Neoplasias.
Rescate medular posterior a radioterapia o quimioterapia de
altas dosis.
Tumores slidos.
Leucemias, linfomas y mielomas.
Hipoplasias medulares.
Anemia aplstica, transtornos genticos.
Las mismas indicaciones que el BMT.
33
Indicaciones.
Usos especficos del PBSCT.
Irradiacin plvica.
Infiltracin neoplsica de la mdula sea.
Hipoplasia de mdula sea.
Neoplasia plvica paramedular.
34
Indicaciones.
Neoplasias tratadas con PBSCT autlogo.
Leucemias crnicas.
Leucemias agudas.
Linfomas no Hodgkin.
Linfomas Hodgkin.
Mielomas mltiples.
Ca de mama.
Ca de ovario.
Sarcoma de tejidos blandos.
Ca. de pulmn de clulas
pequeas.
Neuroblastoma.
Tumor de Wilms.
Otros tumores slidos.
35
Recuperacin.
Factores de recuperacin despus del PBSCT.
Uso de movilizador.
Uso de seleccin y expansin celular ex vivo.
Leucofresis.
Tiempo de almacenamiento.
Origen alognico o autlogo.
Soporte mieloestimulante post-transplante.
Mielofibrosis.
36
Recuperacin.
Parmetros de xito del PBSCT.
ANC 500 clulas/L.

PLT 50,000 plaquetas/L.
37
Recuperacin.
Complicaciones posteriores al PBSCT.
Toxicidad del criopreservador.

Hemorragia.
Infecciones (hongos, CMV, p. carinii).
Falla del transplante.
Rechazo del transplante.
GVHD aguda y crnica.
Problemas psicolgicos.
Otros asociados al tratamiento radio- y/o
quimioteraputico.
38
Recuperacin.
Recuperacin posterior al PBSCT autlogo vs BMT autlogo.
30
30
ANC
ANC
PLT
PLT
25
25
Das
Das
20
20
15
15
10
10
55
00
39
Sin
Sinmovilizacin
movilizacin
Citoc.
Citoc.ooQmTx.
QmTx.
Citoc.
Citoc.yyQmTx.
QmTx.
BMT
BMT
BMT
BMTcon
conQmTx.
QmTx.
Tcnicas en desarrollo.
Seleccin celular mltiple.

Nuevos mieloestimulantes post-transplante.
Expansin ex vivo.
Terapia gentica ex vivo.
Aplicacin en enfermedades autoinmunes.
PBSCT alognico sin compatibilidad HLA.
Vitrificacin como mtodo criopreservador.
Protocolos de PBSCT y quimioterapia seriados.
40
Conclusiones.
El PBSCT es superior al BMT en todas las
aplicaciones si se utiliza seleccin celular.
El uso de DMSO/HES con velocidad de congelacin
no controlada es el mejor mtodo criopreservador.
Las nuevas tcnicas de seleccin y expansin celular
ampliarn la aplicacin del PBSCT.
Muchos protocolos y agentes quimioteraputicos
antes imposibles podrn aplicarse con el PBSCT.
El PBSCT est substituyendo al BMT, tanto el
autlogo como el alognico.
41
42
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Clula sangunea con

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Crioprotectores coligativos previenen la deshidratacin

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Glucosa, manitol y sorbitol a concentraciones mayores

Criopreservacin de clulas madre de sangre perifrica.

Aumentan la supervivencia de las clulas cuando se

Criopreservacin de clulas madre de sangre perifrica.

Sustancia polimrica con cadenas de diferentes pesos

Criopreservacin de clulas madre de sangre perifrica.

Congelador de nitrgeno lquido.

Criopreservacin de clulas madre de sangre perifrica.

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Velocidad de congelacin controlada.

Criopreservacin de clulas madre de sangre perifrica.

Velocidad de congelacin no controlada.

Criopreservacin de clulas madre de sangre perifrica.

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Ventajas de la congelacin no controlada.

Criopreservacin de clulas madre de sangre perifrica.

Se tiene mejor tasa de supervivencia celular con

Criopreservacin de clulas madre de sangre perifrica.

Efectos asociados a la infusin de PBSC.

Criopreservacin de clulas madre de sangre perifrica.

Efectos asociados a la infusin de PBSC.

Criopreservacin de clulas madre de sangre perifrica.

Control de calidad de la criopreservacin.

Conteo (citometra) (tasas de recuperacin de clulas

Criopreservacin de clulas madre de sangre perifrica.

Las mismas indicaciones que el BMT.

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Criopreservacin de clulas madre de sangre perifrica.