ADN RECOMBINANTE

CLONACION DE GENES

Msc. Gabriela Alvite

Seccin Bioqumica Facultad de Ciencias
Agosto 2007

ETAPAS BSICAS PARA LA OBTENCIN DE ADN

RECOMBINANTE

Preparacin del inserto de ADN a clonar

Preparacin del vector
Unin del fragmento de ADN al vector
Introduccin del ADN recombinante en una clula
anfitriona
Propagacin celular y seleccin del clon con el
gen de inters
Anlisis del gen clonado

HERRAMIENTAS DE LA TECNOLOGA DEL ADN

RECOMBINANTE
ENZIMAS
Enzimas de restriccin
Taq ADN polimerasa
Ligasas

VECTORES
Plsmidos
Virus

PREPARACIN DEL INSERTO DE ADN

I.

Amplificacin de ADN mediante PCR

(reaccin en cadena de la polimerasa)

II.

Aislamiento y fragmentacin del ADN

PCR

Repeticin de tres etapas

Desnaturalizacin del ADN (94C)

Unin especfica de los cebadores (50-60C)

Extensin por ADN polimerasa (72C)

PCR
ADN molde
ADN polimerasa termoestable
Taq polimerasa de Thermus aquaticus

Cebadores: Oligonucletidos 10-20 pb

Desoxirribonucletidos trifosfato
(dATP,dTTP,dCTP,dGTP)

Magnesio
Termociclador

ANLISIS DEL pPCR

Electroforesis

Tincin

Gel

Bromuro de etidio

300pb

Transiluminador de luz UV

CARACTERSTICAS

VARIANTES

Rendimiento

hot start PCR

Duracin

PCR larga

Especificidad

PCR anidada

Sensibilidad

RT-PCR

Fidelidad

PCR en tiempo real

ARNm

ARNm
Cebador
Transcriptasa inversa

ADNc
Taq-pol
Cebadores
Nucletidos

ADNc

PCR

RT- PCR

APLICACIONES DE LA PCR

Diagnstico precoz de enfermedades genticas

Deteccin de enfermedades vricas
Medicina forense y criminologa
Estudios evolutivos y Arqueologa molecular
Anlisis de alimentos
Deteccin de patgenos
Identificacin de especies
Deteccin de transgnicos

II. AISLAMIENTO DE ADNg A PARTIR DE

EXTRACTO CELULAR
Lisis celular (SDS, EDTA, ARNasa)
Extraccin de protenas y lpidos
Tratamiento con fenol-cloroformo

Recuperacin del ADN

Precipitacin con etanol en presencia de sales

PURIFICACIN DEL ADNg A PARTIR DEL

EXTRACTO CELULAR

Fenol-Cloroformo
Centrifugacin

Fase acuosa: ADN y ARN

Interfase: Protenas
Fase orgnica:
lpidos y
protenas

Extracto celular

Etanol + sales
Centrifugacin
DNA puro

DNA precipitado

VECTORES
CARACTERISTICAS
Capaces de replicar en la clula anfitriona
De pequeo tamao
De clonacin o de expresin

TIPOS
PLSMIDOS
BACTERIFAGOS
CSMIDOS

PLSMIDOS
CARACTERISTICAS
ADN de cadena doble, circular cerrada (1-200 kb)
Alto nmero de copias
Tienen origen de replicacin y sitio de policlonado
(secuencias nicas para sitios de restriccin)
Llevan genes marcadores: resistencia a antibiticos,
genes que codifican una protena detectable (ej. enzima
-galactosidasa), genes que complementan defectos
nutricionales.

EJEMPLOS DE PLSMIDOS

lacZ
polylinker
pUC18
2686pb

amp
ori

EcoRI
SacI
KpnI
SmaI
BamHI
XbaI
SalI
PstI
SphI
HindIII

VECTOR T

PURIFICACIN DE PLSMIDOS
Obtencin de un extracto bacteriano
- Lisis celular y desnaturalizacin
Lisozima, EDTA, SDS
NaOH o calor
ADN cromosmico y plasmdico se desnaturalizan

- Neutralizacin
ADN cromosmico permanece desnaturalizado y precipita
ADN plasmdico se renaturaliza (en solucin)

ENZIMAS DE RESTRICCIN
EcoRI
Escherichia coli

HindIII
Hemophilus
influenzae

Sma I
Serratia
marcescens

......G-A-A-T-T-C......
......C-T-T-A-A-G......

......A-A-G-C-T-T......
......T-T-C-G-A-A......

A-A-T-T-C......
G......
......G
......C-T-T-A-A
A-G-C-T-T......
A......
......A
......T-T-C-G-A-A

......C-C-C-G-G-G......
......G-G-G-C-C-C......

G-G-G......
C-C-C......
......C-C-C
......G-G-G

FRAGMENTAR EL ADN
ADN con el gen de inters

Vector

Sitio de corte
nico

Enzima
de restriccin

Sitio de corte

Enzima
de restriccin

UNIN DEL ADN AL VECTOR: LIGACIN

ADN digerido con enzima X o producto de PCR

vector digerido con enzima X o vector T

Ligasa

LIGASAS

RESULTADO DE LA LIGACIN

Fragmentos de ADN Molculas del vector

no ligado
no ligado

ADN recombinante que no

contiene el gen de inters

Molculas del vector

religado

ADN recombinante con

el gen de inters

INTRODUCCIN DEL ADN RECOMBINANTE

EN CLULAS ANFITRIONAS:
TRANSFORMACIN

Alteracin transitoria de la permeabilidad celular:

clulas competentes
Tratamientos qumicos
Cloruro de calcio, cloruro de rubidio

Aadir la mezcla de ligacin

Tratamiento trmico

Otros procedimientos de transformacin

Electroporacin
Biovalstica
Microinyeccin

TRANSFORMACIN EN BACTERIAS

Plsmido
CaCl2

Clula bacteriana
normal

42C, 2min

Clula bacteriana
competente

Clula transformada

OBTENCIN DE CLONES
Las clulas se cultivan en un medio slido
selectivo (placas con antibitico, sustrato)
Cada clula se multiplica y forma una colonia o
clon
Todas las clulas de un clon son idnticas
En el interior de cada clula, el vector con el
fragmento de ADN exgeno se replica

RESULTADO DE LA TRANSFORMACIN

Clulas con el vector

religado

Clulas con ADN recombinante

que no contiene el gen de inters

Clulas con ADN recombinante

con el gen de inters

BIBLIOTECA DE ADNg

Conjunto de clones recombinantes en el que est

representado todo el ADN de un organismo

BIBLIOTECA DE ADNc

Conjunto de clones recombinantes obtenidos a partir de

los ARNs mensajeros de un organismo o tejido
determinado

Facilita la clonacin de genes de organismos superiores

Facilita la expresin de genes de organismos superiores en

procariotas porque elimina los intrones