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Aula 8: Micro-organismos e
Engenharia Gentica
Aula 8: Micro-organismos e
Engenharia Gentica
1. Introduo
Engenharia Gentica ou
Tecnologia do DNA
Recombinante (1973)
Micro-organismos importantes ferramentas
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Engenharia Gentica
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E. coli geneticamente
modificada
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2.
Vetor
Viso Geral
da Engenharia
Gentica
3.
Hospedeir
o
1.
Gene
de
interes
se
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Exemplos do micro-organismos
hospedeiros
Bactrias: E. coli
Leveduras: S. cerevisiae
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Plasmdeo
Vetor de clonagem
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3. Isolamento do
DNA do vetor
4. Tratamento
com enzima de
restrio e
ligao
5. Transformao
da clula
hospedeira
6. Identificao
da clula
recombinante
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Clula intacta
1. Isolamento
do DNA doador
DNA
Lise celular
Liberao do DNA
Purificao
do DNA
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passos:
Passo 1:
Desnaturao
Passo 2:
Anelamento
Passo 3:
Extenso
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Cromossomo
Lise celular
Liberao do
DNA plasmidial e
cromossmico
Cloreto de
csio e
brometo de
etdeo
DNA cromossomal
DNA plasmidial
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4. Enzimas de restrio
Presentes em quase todos os micro-organismos
Reconhecem e clivam stios especficos na sequncia
do DNA (4-6 pares de bases)
Produo de terminais cegos ou coesivos
Terminais cegos
Terminais coesivos
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Clivagem
Extremidades coesivas
Os fragmentos de
DNA unem um ao
outro por
complementaridad
e!
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Ao das
enzimas de
restrio
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Kit de extrao de
DNA plasmidial
Kit de clonagem
de DNA
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Transformao
Mtodo utilizado para inserir os
plasmdeos nas clulas hospedeiras
Transformao com cloreto de clcio
e choque trmico
Transformao por eletroporao
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Transformao de E. coli
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Plasmideo
Plasmdeo
recombinante
recombinante
Plaqueamento
dos
transformantes
Cromossomo de
E. coli
Clulas transformadas
sobrevivem em
placa com ampicilina
Aplicado estmulo
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Deteco da
bactria
recombinante
Seleo
branca-azul
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Seleo branca-azul
Apresentam dois marcadores de seleo
DNA de interesse
inserido no meio do
gene lacZ
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Hibridao de colnias
Emprego de sonda de DNA para identificar colnias contendo o
gene de interesse
As sondas de DNA so complementares ao gene desejado
Tais sondas so marcadas por radioatividade ou fluorescncia
marcao
sonda de
DNA
DNA de
interesse
Membrana
Hibridao de
colnias
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Sntese de cDNA
Transcriptase reversa
- Fita molde: mRNA
A fita de cDNA
sintetizada pela
transcriptase reversa.
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Produtos
farmacuticos
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Produtos para
agricultura e pecuria
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Animaes no Youtube:
https://www.youtube.com/watch?v=juP6iHMIYkE
https://www.youtube.com/watch?v=GDlOE9TveCI