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EQUIPO

Catay Sotelo Karla Marleny

Quispe Malpartida Suly Vanessa
Prieto Villanueva

Briggit Susan

Saucedo Estela Pamela

Yanina
Tocto Cespedes Jhomaira karen
Alcedo Mora Carlos
Profesora: Elena Maucapoma Luna

UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA

CARRERA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUMICA

Electroforesis
La electroforesis es una tcnica que se basa en la separacin de molculas
segn la movilidad de estas en un campo elctrico.
Tipos:
De frente mvil (en solucin)
De zona (sobre un medio soporte)

En papel

Slice

Geles (a travs de una matrz porosa)

Agarosa

Poliacrilamida

(DNA)

(DNA y protenas)

ELECTROFORESIS
La electroforesis esta basada en la movilidad de las molculas cuando se
encuentran bajo el efecto de un campo elctrico

Puede llevarse a cabo en:

Solucin
Superficie hidratada de un soporte slido (papel o acetato de celulosa)
Matriz porosa (en gel de poliacrilamida o agarosa)

Se puede controlar el tamao del poro

efecto de tamiz molecular

ELECTROFORESIS
Ctodo

+ +
nodo

Electroforesis: migracin de
una
partcula
cargada
sometida
a
un
campo
elctrico

ELECTROFORESIS
Ctodo

Velocidad = E

q
f

+ E: gradiente de potencial. E=V/d

+
nodo

q: carga elctrica de la partcula (depende de pH)

f: coeficiente de friccin
tamao
forma

Criterios de separacin electrofortica

Ctodo

q (carga)
Velocidad = E
f (tamao, forma)

+ 1. Separacin por tamao

+
nodo

2. Separacin por carga

3. Separacin por tamao y carga

Factores que afectan la electroforesis

La electroforesis depende del campo elctrico y este depende de
distintos parmetros:

V RI

Ley de Ohm

V = diferencia de
potencial

define el campo elctrico, la velocidad de avance es

directamente proporcional a ella

R = resistencia

la movilidad de las molculas es inversamente

proporcional a ella

I = intensidad

cuantifica el flujo de carga elctrica, se relaciona

directamente con la distancia recorrida por las
molculas

Temperatura

es necesario controlar el aumento de

temperatura debido al Efecto Joule

ELECTROFORESIS
DE TIPO VERTICAL

LA ELECTROFORESIS EN PROTEINA

Es un mtodo de abordaje
sensible
para
detectar
innumerables alteraciones de
estados patolgicos y disfuncin
de varios rganos, que no pueden
definirse por otros mtodos.

QUE PATOLOGA SE DIAGNOSTICA

Se
diagnostica
monoclonal

la

protena

Es un anticuerpo que se encuentra

en cantidades grandes como en la
sangre o la orina de las personas
con mieloma mltiple y otros tipos
de tumores de clulas plasmticas.

PRINCIPIO TCNICO

Este estudio se basa en la propiedad de las protenas para moverse segn su

peso molecular y su carga elctrica, al colocar una muestra de suero del
paciente en una matriz y aplicar un voltaje.

En el suero hay protenas con carga + y pero, a un pH alcalino todas las

protenas quedan con carga elctrica negativa y migrarn del Ctodo (-) hacia
el nodo (+)

Son bsicamente 10 a 12 protenas las responsables de la formacin de las

bandas caractersticas de la electroforesis de protenas.

ELECTROFORESIS EN ADN

Es un mtodo sencillo empleado de

forma rutinaria en laboratorio para
separar molculas biolgicas.

Permite separar especies qumicas

a lo largo de un campo elctrico en
funcin de su tamao y de su carga
elctrica.

PRINCIPIO TCNICO

El ADN tiene por naturaleza carga negativa.

Si ponemos fragmentos del ADN extrado de una

muestra biolgica sobre un soporte poroso (gel) y
aplicamos un campo elctrico, se producir la
migracin diferencial de los fragmentos a travs de
los poros de la matriz.

La tincin del gel con bromuro de etidio, que es

una sustancia fluorescente que se intercala en la
molcula de ADN, y la exposicin con luz
ultravioleta, permite observar el resultado de sta
migracin.

PROCEDIMIENTOS PARA LA
ELECTROFORESIS DE ADN
Tocto

KAREN

VARIANTES DE ELECTROFORESIS

Electroforesis bidimensional

Electroforesis de capilaridad

Electroforesis en campo pulsado (PFEG)

PRIETO

Electroforesis de campo pulsado

Para molculas muy grandes: electroforesis de campo pulsado.
Permite analizar molculas de ADN de hasta 10000 Kpb (cromosoma
de levadura)

Electroforesis en dos dimensiones

Primera dimensin: isoelectroenfoque
Segunda dimensin : SDS-PAGE

Permite analizar mezclas ms complejas como extractos celulares, muestras de

sangre, etc

Isoelectroenfoque
Se lleva a cabo en un gradiente de pH que se establece entre dos
electrodos
El gradiente de estabiliza utilizando anfolitos

nodo

Las protenas migran hasta alcanzar un pH

igual a su punto isoelctrico
Es muy til para estudiar modificaciones
postraduccionales en protenas, trabajar
con isoenzimas, etc

ctodo

Electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE)

Dodecil sulfato de sodio (SDS)

Desnaturaliza las protenas

Confiere cargas negativas unindose en proporcin al tamao de la
protena (una molcula de SDS por cada dos aminocidos, ~1.4 g
SDS/g protena)

Polipptidos distintos tienen

la misma densidad de carga

migran solo segn su peso molecular

Electroforesis capilar
Las muestras pueden correr en
solucin o en gel
Aumenta la relacin
superficie-volumen: permite
un mejor control de la
temperatura y por lo tanto la
posibilidad de aplicar
voltajes mayores
Se siembran volmenes pequeos de muestra, pero sta debe estar
concentrada
La deteccin implica observar las bandas de protena a medida que estas
pasan por una seccin de capilar (deteccin UV, fluorescente,
espectrometra de masa)
Solo se puede analizar una muestra a la vez, pero es una tcnica rpida,
no implica tincin y los datos obtenidos son cuantitativos

Visualizacin de las bandas en el gel

1. Tincin
Azul de Coomassie:
se une a las protenas en forma especfica (~0.1 g de protena)
es necesario un paso de desteido
Plata:
100 veces ms sensible que la tincin con Coomassie
Es necesario en primer lugar fijar las protenas al gel para minimizar la
difusin
Se expone al gel a una solucin de nitrato de plata y ste es reducido a
plata metlica donde se encuentran las protenas produciendo la
precipitacin de granos de plata
Puede presentar importantes backgrounds, es ms cara e implica ms

Azul de Coomassie

Plata

la electroforesis en
asociacin con otras
tcnicas tales como PCR e
Hibridacin
La tcnica de la PCR (Polymerase Chain Reaction=
Reaccin en Cadena de la Polimerasa) permite la
amplificacin de un fragmento de ADN de inters.
El uso de esta tcnica es muy amplio en el campo
de la medicina.

Esta tcnica sirve para amplificar un fragmento

de ADN; su utilidad es que tras la amplificacin
resulta mucho ms fcil identificar con una
muy
alta
probabilidad,virus
obacteriascausantes
de
unaenfermedad,
identificar personas (cadveres) o hacer
investigacin
cientfica
sobre
el
ADN
amplificado. Estos usos derivados de la
amplificacin han hecho que se convierta en
una tcnica muy extendida, sobre todo en el
mbito de la investigacin forense, con el
consiguiente
abaratamiento
del
equipo
necesario para llevar a cabo dicha tcnica.

Principios bsicos de la electroforesis

La

idea es poder analizar el o los

fragmentos obtenidos en el PCR,
y la electroforesis, ya sea en
geles de agarosa o de acrilamida,
permite separar estos fragmentos
de acuerdo al tamao de cada
uno.

VERIFICACIN DE LA CALIDAD PTIMA DE LOS

EQUIPOS Y REACTIVOS EMPLEADOS
Para
el
caso
del
TEMED
((N,
N,N,N
tetrametiletilenodiamina) el cual es adquirido en
condiciones de refrigeracin, el control de calidad se
realiza
preparando
geles
de
poliacrilamida.
Generalmente, la polimerizacin no debe demorar ms
de media hora.

La

acrilamida/

importante

que

bisacrilamida
en

polvo

es

puede

otro

reactivo

guardarse

temperatura ambiente; sin embargo, en estado de

solucin puede mantenerse en refrigeracin hasta
por 6 meses.

BUFFER PARA ELECTROFORESIS DE PROTENAS Y

ADN
Como buffer de electroforesis y para la preparacin
del gel puede utilizarse opcionalmente TA E (TrisAcetato EDTA) o TBE (Tris-Borato EDTA). El TAE tiene
una menor capacidad de amortiguacin que el TBE, y
puede resultar en una acidificacin del medio, si la
electroforesis se desarrolla durante un periodo muy
prolongado, pero funciona muy bien con tiempos
normales de electroforesis, adems tiene una mayor
capacidad de resolucin que el TBE para tamaos
grandes de ADN.

PERSULFATO DE AMONIO

En el caso del APS es un reactivo que se caracteriza por ser

altamente higroscpico, es decir, suele hidratarse con facilidad.
Por lo tanto, deber realizarse un control peridico del frasco que
lo contiene fin de evitar la humedad en su interior y
consecuentemente la prdida de sus propiedades qumicas
durante el proceso de polimerizacin.

Para controlar la calidad de este reactivo verificar que el

contenido no se encuentre endurecido ni que se hallen gotas de
agua en su interior. De otro lado, preparar geles de
poliacrilamida usando

APS al 10% y verificar que la polimerizacin no demore por ms

de media hora. Para evitar la hidratacin del APS se recomienda
guardarlo en ambientes secos asegurando la tapa con lmina
extensible de parafina.

BROMURO DE ETIDIO

La solucin de trabajo (1 g/mL) debe tener un color

casi transparente. Una vez preparada la solucin,forrar
el frasco con papel aluminio y rotular.

La calidad del bromuro de etidio puede ser verificado

visualizando concentraciones de ADN desde 50pg en
un gel de agarosa incubado durante 5 minutos. La
visualizacin de la mnima concentracin de ADN
permitir determinar la calidad ptima del bromuro de
etidio.

El contacto de este reactivo con la luz puede ocasionar

la prdida de sus propiedades fluorescentes por lo que
se recomienda incubar los geles en oscuridad.

AGAROSA

La continua licuacin de la agarosa incrementa su

concentracin por deshidratacin alterando el perfil
de las bandas al final del resultado. Por lo tanto, se
recomienda preparar soluciones de agarosa en
volmenes no mayores de 200 mL y verificar
constantemente la turbidez de la agarosa antes de
la preparacin del gel.

De otro lado tambin se recomienda, verificar la

presencia de residuos extraos en la solucin ya
que pueden interferir con el anlisis del resultado
final y con la electroforesis misma. Por lo tanto, ser

necesario preparar una nueva solucin a fin de

superar este inconveniente.

Problemas en la electroforesis

ELECTROFORESIS: TINCIONES
COLORANTE

ESPECIFICIDAD
SENSIBILIDAD

COMENTARIOS

Amido Black o Negro

Amido 10B o Amido Schwartz

Tincin general
Sensibilidad: 1 g/banda

Mejora con fijacin previa .

Diferente grado de unin segn la
protena.
Diferente grado de unin segn la
protena. Tincin estable.
Apropiado para densitometra.

Coomassie Blue R-250

Tincin general
Sensibilidad: 0,2-0,5 g/banda

Xylene Cyanine Brilliant G o

Coomassie Blue G-250

Tincin general
Aumenta la sensibilidad x3 en TCA Apropiado para densitometra.
despus de la tincin

Verde Lisamine

Tincin general

Rojo Ponceau 2S

Tincin general. Sensibilidad:

alreddor de 0,5 g/banda

Tinciones con plata y

combinaciones con
otros colorantes

Sensibilidad: 100 veces > tinciones Laborioso. Varios protocolos.

generales
Polisacridos y DNA.
No reaccionan todas las
protenas.

Tincin ms uniforme con todas

las protenas sricas.

Bibliografa
1 .Instituto Nacional de Salud. Normas de Bioseguridad. 2 ed. Lima: Instituto National de Salud.
2002. Serie de Normas Tcnicas N 18.
2. Maizel RM, Blexter ML, Robertson BD, Selkirk ME. Parasite antigens parasite genes. A laboratory
manual for molecular parasitology. Cambridge: Cambridge University Press; 1992.
3. Montoya Y, Len C, Maturrano L, Muoz-Najar U, Nolasco O, Talledo M, et al. Gua de
Prcticadel Curso Terico-Prctico: Electroforesis de protenas y cidos nucleicos.Lima: Instituto Nacionalde Salud; 2004.

GRACIAS