Extracie i purificarea ADN

Extracia ADN
Comport:recoltarea i pstrarea probelor i extracia
propriu-zis
Probele ADN trebuie potejate de: inhibitori ai
enzimelor utilizate (inhibitori ai Taq polimeraz),
nucleaze care pot degrada acizii nucleici (ARN este n
special sensibil).
Frecvent sunt probe totale de snge ele pot fi
separate n plasma , ser i leucocite. Alte medii curent
folosite sunt din:culturi (fagi, bacterii), urin, lichid
cefalorahidian, expectoraii, probe rezultate prin
puncionare i biopsie.
Condiii de prelevare
Probele trebuiesc recoltate steril.

 O prob de snge poate fi colectat n tub uscat dac

cercetrile obinute se realizeaz din ser sau pe EDTA
sau ACD dac se lucreaz pe plasm.
Este recomandat lizarea globulelor roii nainte de
extracia ADN ( de exemplu liza cu clorur de
amoniu) apoi purificarea globulelor albe.
Dac se utilizeaz un anticoagulant trebuie s inem
cont de natura sa. Heparina este un inhibitor pentru
Taq polimeraz mai mult sau mai puin dificil de
eliminat dup procesul de extracie utilizat.
Probele de snge total destinat unei analize genetice
ADN poate fi trimis prin pot. Acesta poate fi
conservat la 4C cteva sptmni
esuturile sunt bogate n nucleaze (proteaze, DNaze
i RNaze).
n cazul LCR este recomandat pstrarea la frigider,
imediat dup recoltare. Este cunoscut faptul c LCR i
urina sunt medii bogate n inhibitori.

 ARN este o molecul fragil, foarte sensibil

la RN azele care sunt frecvente n mediu
pn i pe degete.
n cazul studiilor de ARN probele sau
fraciunile lor trebuiesc congelate la -80C n
primele 3 ore dup recoltare.
Probele pot fi expediate n ghea carbonic.
n timpul manipulrii este indispensabil s
evitm contaminarea probei i ARN s fie
conservat (este fragil).
Se recomand: purtarea mnuilor,
autoclavarea materialelor, utilizarea de pipete
special rezervate acestui scop la capete cu
filtre sterile.

 n funcie de tipul ADN-ului se cunosc 2

tehnici de extracie pentru tipul genomic i
pentru cel plasmidic.
Extracia ADN cromozomial sau genomic
Metoda fenol cloroform
Extracia ADN din snge total este cea mai
utilizat. Parcurge 3 etape:
-liza celulelor i denaturarea complexelor
nucleoproteice pentru eliberarea ADN din
mediul intracelular
-extracia propriu-zis pentru eliminarea
proteinelor
-precipitarea pentru purificarea ADN

 Obinerea fraciunii de extras

n practic ADN situat n celulele nucleate se
recupereaz centrifugnd leucocitele pe baza
gradientului de densitate.
Se poate centrifuga tubul la vitez joas i se
recolteaz de la interfa dintre plasm i
coagulul de globule roii.
Dup splare cu soluie tampon proba este
gata de extracie.
n cazul mycobateriilor eliberarea acizilor
nucleici necesit un tratament mai drastic pe
baz de ultrasunete sau asociate cu sod
caustic i nclzire, sau adugnd
detergeni SDS i proteinaza K.

 Este indispensabil spargerea peretelui

mycobacterian care este foarte rezistent.
Liza celulelor i denaturarea complexelor
nucleoproteice pentru eliberarea ADN din mediul
intracelular
Un sistem utilizat curent adaptat la toate tipurile de
probe este amestecul detergent/proteinaz care
disociaz esuturile, celulele, capsida virusurilor i
eliberaaz acizii nucleici.
Proteinaza K, enzim utilizat pentru extracia acizilor
nucleici.
Diger celule ntregi, nucleul chiar esuturi fcnd
astfel accesibil ADN i ARN.
Este stabil la 40-60Ci eficace n prezena
detergenilor, dintre care cel mai bun este SDS
(dodecylsulfat de sodiu) anionic. Ea i pierde
activitatea proteazic la temperatua de 90C.

 Extracia propriu-zis
ADN coninut n lizat este separat de proteine prin
tehnica fenol/cloroform. Fenolul este un agent
deproteinizant puternic.
Adiia sa la faza apoas are ca efect denaturarea
proteinelor din mediu. Dup centrifugare ele se
depoziteaz, n timp ce acizii nucleici sunt situai
n faza apoas.
Dup transferul fazei apose n alt tub, acizii nucleici
sunt tratai cu un amestec cloroform/alcool
izoamilic pentru a elimina urmele de fenol (care
este un produs toxic i inhibitor al anumitor enzime
inclusiv Taq polimeraza).
n acest stadiu dup centrifugarea i eliminarea fazei
organice acizii nucleici se gsesc solubilizai n faza
apoas.

 Precipitarea ADN
Permite obinerea ADN pur, concentrat i se
face fie cu etanol 100% la -80C, fie cu
izopropanol (fr sruri i la +4C) mai ales
pentru probe de volum mai mare.
Este indispensabil o splare cu etanol 70%
pentru eliminarea srurilor.
Precipitatul este transferat ntr-o soluie tampon
cu for ionic slab n general utiliznd
tampon TE (Tris 10 mM i EDTA 1 mM).

 Extracia ADN plasmidic

n cercetare plasmidele sunt utilizate pentru
inserarea unor secvene care sunt multiplicate
concomitent n celule gazd (E.coli).
Extracia are ca scop separarea ADN
plasmidic de cel al celulei gazd.
Tehnica cea mai frecvent include o etap de
liz alcalin n prezena de SDS n care cele
dou tipuri de acizi nucleici sunt denaturai.
pH neutralizat rapid face ca ADN plasmidic
s fie solubil iar cel cromozomial se
transform n agregat insolubil incluznd i
proteine denaturate i SDS precipitat.

 Dup centrifugare ADN plasmidic coninut

n supernatant, este precipitat cu etanol i
depozitul dup centrifugare este eluat cu TE
sau ap steril.
Exist numeroase variante. Utilizarea de cuar,
rini, ageni haotropici i kituri pe baza acestor
procedee.
Tehnica fenol/cloroform este adaptat extraciei
ADN plasmidelor.
Extracia ARN
Eliberarea ribonucleazelor
RNazele sunt ubicvitare i dificil de inactivat,
deoarece spre deosebire de ADNaze
funcionarea lor nu necesit cofactori.

 Unele esuturi ca pancreasul, sunt foarte

bogate n RNaze.
Dei nu este posibil s le eliminm, ele sunt
capabile s se renatureze dup supunerea
la oc termic.
Totui dup nczire adaosul de
mercaptoetanol agent reductor, ajut la
pstrarea RNazelor n stare denaturat
mpiedicnd reformarea punilor disulfidice.
Este indispensabil neutralizarea aciunii lor n
lizatul celular tratnd proba cu detergeni i
ageni haotropici ca mercaptoetanol i
tiocianat de guanidin.

 n laborator sunt dou surse de contaminare cu

RNaze: minile operatorului i germenii n suspensie
din aer care se depun pe sticlrie i consumabile.
Deci este esenial s se lucreze permanent cu
mnui, s se utilizeze materiale de unic folosin,
sticlria s fie tratat cu dietilpirocarbonat (DEPC
0,1%) inhibitor puternic de RNaz - apoi autoclavat
( DEPC intr n reacie cu bazele purinice), fie s fie
supus la temperaturi foarte mari (200C) la autoclav
fr tratament cu DEPC.
Materialul plastic este decontaminat cu sod caustic
0,1 N i EDTA 1 mM apoi splat cu DEPC. Reactivii i
tampoanele trebuie tratate cu DEPC apoi autoclavate.
Pentru tamponul TRIS nu se face autoclavare dar se
utilizeaz ap tratat cu DEPC pentru prepararea
tamponului. Apa deionizat este n principiu lipsit de
ARNaz.

 Sunt necesare trei etape succesive pentru obinerea

ARN purificat.
1. Liza celular. Se folosesc dou grupe de
detergeni puternici care inhib RNazele. n prima
grup agentul disociant utilizat este tiocianatul de
guanidin (GTC) iar n a doua se asociaz cu
mercaptoetanol. Ambii sunt inhibitori de RNaz.
Utilizarea combinat permite disocierea proteinelor
liza celulelor, inactivarea RNazelor i denaturarea
ARN.
Dac se dorete eliminarea riscului de contaminare
ARN cu ADN este necesar tratarea cu DNaz.
Tehnica unete metode care necesit utilizarea
fenolului i a detergentului. Adesea se adaug un
inhibitor de RNaze /RNasin) izolat din pancreas de
bovine. RNazele sunt de asemenea inactivate cu

 2. Extracia propriu zis a ARN

ARN este extras cu fenol/cloroform. Separarea se
face pe baza precipitrii diferite a ARN i ADN n
funcie de pH. n condiii de pHacid ARN rmne n
soluie apoas.
n mediu alcalin ADN rmne n soluie apoas.
250l material patologic (sange integral, ser, lichid
de ascita) + 1000l ARN + 250l cloroform in
tuburi eppendorf de 1,5 ml;
pentru fecale se dilueaza o cantitate de 1 ml apa D,
se vortexeaza foarte bine, apoi se centifugheaza,
iar lichidul clar se repartizeaza in tuburi si se
prelucreaza la fel ;
se agita foarte bine si se cenrifugheaza 15 minute /
12000 rpm, la +40C . Dupa centrifugare se observa
aparitia a doua faze (una guanidinica la baza
tubului si una apoasa, in care se gaseste ARN-ul)

 in alt tub eppendorf de 1,5 ml se recolteaza cu

atentie faza apoasa (lichid foarte clar), in
cantitate aproximativa de 700l ;
peste aceasta se adauga 700l izopropanol
se introduc tuburile la congelator la -200C,
unde se lasa pana a doua zi;
se centrifugheaza 20 de minute / 12000 rpm, la
+40C, dupa care se poate observa la fundul
tubului, ARN-ul precipitat sub forma unui buton,
cu o marime direct proportionala cu cantitatea
de ARN din proba ;

 se indeparteaza izopropanolul si se
inlocuieste cu 1000l etanol 60% si se
centrifugheaza 20 minute la 12000 rpm, la
+40C ;
se indeparteaza toata faza lichida din tub,
ramanand doar depozitul de ARN ;
se introduce la termostat la 370C pentru uscare
(10-15 minute), pana cand depozitul devine
translucid ;
se adauga 50l apa distilata si se
omogenizeaza foarte bine si se conserva la
-800C .

 Pentru determinarea concentratiei de ARN din proba

se detemina densitatea optica (DO) a unui amestec
ce contine 95l apa distilata si 5l ARN. Lungimea de
unda la care se face citirea este de 260 nm. Formula
dupa care se calculeaza cantitatea de ARN este
urmatoarea :
[ARN] = DO(260 nm) x 40 x 20
40 factor de corectie
20 dilutia
Rezultatul se exprima in g/ml .
[ADNds] = DO(260 nm) x 50 x 20
50 factor de corectie
20 dilutia
Rezultatul se exprima in g/ml .

Proba

DO (260nm)

Concentratia ARN (g/ml)

43

0,067

53,6

44

0,064

51,2

45

0,186

148,8

45bis

0,116

92,8

46

0, 189

151,2

47

0,061

48,8

48

0,036

28,8

49

0,088

70,4

50

0,057

45,6

50 bis

0,100

80

51

0,055

44

52

0,064

51,2

53

0,053

42,4

53 bis

0,143

114,4

55

0,072

57,6

55bis

0,081

64,8

56

0,035

28

56bis

0,075

60

57

0,065

52

57bis 1

0,039

31,2

57bis 2

0,043

34,4

58

0,291

232,8

 3.Precipitarea ARN. Se efectueaz similar cu

a ADN cu izopropanol sau etanol de
asemenea se face splare cu etanol 70%.
ARN se mai poate obine cu bile magnetice.
Exist numeroase kituri de extracie rapid.
Dozarea ARN. Poate fi necesar n Northern
blot, RNazin Protein Assey.
Spectrofotometria. Este cea mai utilizat i
msoar densitatea optim la 260-280 nm a
unei diluii de ARN.

 Sinteza unui ADNc in vitro

Manipularea i studiu ARN este diferit din
cauza marii sensibiliti la ribonucleaze care-l
distrug. Este necesar recopierea secvenei de
ARN pentru a crea o structur stabil i care va
fi amplificat n funcie de necesiti.
ARNm purificat, utilizd cromatografia prin
afinitatea pe o coloan de oligodezoxitimidina,
este legat n prima etap cu oligonucleotide
poliT care se ataeaz la coada polyA.
Pornind de la extremitatea 3 a acestei amorse
poly T, transcriptaza invers, care este o ADN
polimeraz, sintetizeaz un lan de ADN
complementar al mesagerului de pornire

 Odat ce s-a realizat aceast sintez se degradeaz

ARN printr-o baz tare sau o ribonucleaz
specific.
Lanurile de ADN constituite formeaz spontan o
bucl la extremitatea 3, sub forma de agraf de pr,
care se hibrideaz pe ea nsi.
Extremitatea 3 a acestei bucle va servi ca situs de
demaraj pentru ADN polimeraza, care va sintetiza
un lan de ADN complementar primei. O
ribonucleaz specific ADN-ului monocatenar va
suprima bucla la extremitate.
ADNc dublu catenar este sintetizat. Se poate astfel
constitui att ADNc ci ARNm exist ntr-o celul;
ansamblul acestor ADNc formeaz o banc de
ADNc.

 Electroforeza
Electroforeza este o metoda de separare a
particulelor incrcate electric prin migrare
diferenial sub actiunea unui cmp electric. Ne
permite cuantificarea de manier precis a ADN i
ARN, iar n anumite cazuri, aprecierea cantitii de
acizi nucleici prezeni (prin raportarea la un marker
de talie cunoscut).
Se poate utiliza hrtie, acetat de celuloza, gel de
poliacrilamid, gel de agaroz, gel de amidon, gel de
siliciu. Exist dou tipuri de gel utilizate mai frecvent
agaroz i poliacrilamid care permit o separare
mai bun.
Agaroza, polizaharid extras dintr-o varietate de alg
roie, este un polimer al unei uniti dizaharidice; la
nclzire n soluii apoase formeaz hidrosoli, care la
rcire se transform n hidrogel.

 Electroforeza n gel poliacrilamid

Gelul de poliacrilamid se formeaz prin polimerizarea vinilic
a monomerilor de acrilamid CH2=CH-CO-NH2 n lanuri
lungi de poliacrilamid i prin reticularea lanurilor n urma
includerii unui comonomer bifuncional adecvat de obicei
N, N metilen bisacrilamid (Bis).
CH2=CH-CO-NH-CH2- NH-CO-CH=CH2
Reacia de polimerizare d natere n mod aleatoriu unor
asemenea lanuri de poliacrilamid ce ncorporeaz o mic
cantitate de molecule Bis, acestea putnd reacioana cu alte
grupuri ale altor lanuri determinnd reticularea i formnd o
reea.
Concentraia poliacrilic utilizat determin lungimea
medie a lanului de polimer, n timp ce concentraia de Bis
determin gradul de reticulare.
Ambele concentraii decid proprietile fizice ale gelului
precum densitatea, elasticitatea , rezistena mecanic i
dimensiunile porilor.

 n trecerea prin mediul de agaroz sau acrilamid,

moleculele se separ n funcie de dimensiune.
Cele mai mari sunt reinute, iar cele mai mici
migreaz.
Acrilamida are putere mai mare separatoare dect
agaroza ns este mai toxic.
Tehnica electroforezei
Dup formarea, turnarea gelului, trasarea godeurilor i
solidificarea acestuia se vor introduce probele de
ADN.
n primul godeu se introduce un marker cunoscut,
care permite estimarea mrimii fragmentelor de ADN.
Se utilizeaz frecvent ADN de fag restrictat cu o
anumit enzim. Fragmentele rezultate au o mrime
cunoscut, ceea ce permite folosirea lor ca etalon.
n godeurile rmase se introduc pe rnd probele care
urmeaz s fie analizate.

 Se adaug doi colorani: unul bine vizibil pe gel

care va migra foarte rapid, albastru de bromfenol,
pus naintea fragmentelor de ADN pentru a delimita
distana parcurs pn la anod.
Al doilea, bromura de etidiu, care se intercaleaz
ntre bazele de acizi nucleici i imprim o culoare
oranj cnd acestea sunt expuse la lumina UV.
Astfel, moleculele de ADN complexate cu bromur
de etidiu devin vizibile.
Aparatul de electroforez se cupleaz la o surs de
curent . Polul pozitiv este opus godeurilor.Cnd
frontul de migrare ajunge n apropierea captului
opus al gelului, se ntrerupe sursa de curent. Se
scoate tvia cu gel i se vizualizeaz n UV la 254
nm, se vor fotografia fragmentele de ADN digerate
n gel.

 Distana de migraie este proporional masa

molecular: exist o proporionalitate invers ntre
mobilitatea i logaritmul masei, dar relaia este
valabil pentru moleculele liniare avnd sub 20 kb.
Se determin astfel mrimea fragmentelor de
restricie obnute i se compar cu a celor de
mrime cunoscut.
migrarea moleculelor mari de 20kb este aproape
independent de mrime i nu mai apare o relaie de
linearitate;
conformaia cerc deschis CD/OC - open circle, cerc
covalent nchis CCI/CCC covalenty closed cirle. La
aceeai mas molecular, CCI au cea mai mare
mobilitate pe cnd conformaia CD este mai lent.
Moleculele liniare au o mobilitate intermediar.
tamponul de electroforez folosit este Tris Acetat
(TAE).

 Dup migrare probele se citesc la UV.

n unele cazuri moleculele care trebuiesc separate sunt
marcate prin ncorporarea unui izotop radioacitv care
permite detectarea prin autoradiografie. Particulele
energetice emise de radioizotop imprim un film fotografic pe
gel. Se developeaz pentru a se vedea benzile negre care
corespund moleculelor marcate radioactiv.
Efectele dimensiunii porilor
n mediile gelificate, trecerea oricrei particule este ntrziat
de structura matricei i depinde de mrimea relativ a
particulelor i a porilor din reeaua gelului. Att dimensiunile ct
i sarcina moleculelor au un rol important n procesul de
separare.
n gelurile de agar dimensiunea porilor este mare .
Poliacrilamida are avantajul uurinei cu care mrimea
porilor poate fi modificat prin concentraia acrilamidei i a
proporiei de agent de reticulare. Pe msura creterii
proporiei de agent de reticulare cinetica de reacie este
ncetinit i matricea de gel devine mai puin omogen.

 Alegerea gelului i a sistemului tampon adecvat

De exemplu un amestec de proteine virale sau acizi
nucleici cu greuti moleculare mari ar putea
impune alegerea unui gel cu pori mari avnd o
concentraie de poliacrilamid T sub 5% pentru a
evita efectul excesiv de sit molecular.
T=15-20% sau mai mult se preteaz pentru
polipeptide ori histone cu greutate molecular
mic, aceste concentraii accentund diferenele
minore de dimensiuni n cadrul aceluiai nivel de
greutate molecular.
La separarea unui amestec de proteine este puin
probabil alegerea acelui set de condiii s poat
garanta cel mai bun grad de separare a fiecrei
componente de celelalte.
Dac ntr-un gel se obine o singur band aceast nu
conine n sine dovada prezenei unei singure
componente omogene.

 Gelurile plate verticale

Grosimea gelurilor 0,5-1,5 mm. Cu ct sunt mai subiri cu
att sunt mai rapide i eficiente pentru colorare,
decolorare, iar rcirea din timpul electroforezei este mai
rapid i mai uniform. Aceasta permite aplicarea unei
tensiuni mai mari i a unor timpi de aciune mai redui.
Gelurile sunt obinute n forme separate care ulterior sunt
inserate n aparat cu ajutorul unor garnituri de cauciuc i
introduse n tamponul ce reprezint mediul de rcire (rcire
realizat prin mijlocirea tuburilor de ap).
Un colorant trasor este albastru de bromfenol. Acesta
migreaz cu o vitez mai mare dect oricare dintre
componententele macromoleculare ale probei i indic
momentul stoprii electroforezei.
Gelurile se introduc n baie de colorant cu bromur de etidiu 3
minute, apoi se examineaz la o lamp cu ultraviolete.

 Lipoproteinele, au caracter parial proteic pot fi

colorate naintea electroforezei pentru a le deosebi de
proteine. Se folosete Sudan Black B.
Exist densiometre laser care scaneaz gelurile la
nivele de rezoluie extrem de ridicat. Rspunsul
scanner-ului poate fi computerizat ceea ce permite
nregistrarea, redarea, evaluarea i stocarea datelor
pe disc sau imprimarea lor, precum i compunerea a
dou geluri diferite.
Semnalul densiometric este preluat pe un nregistrator
i este cuantificat prin msurarea suprafeelor de sub
peak-urile individuale.
Se poate recurge la integrarea electric sau prin
achiziionarea de date pentru calcul computerizat al
suprafeelor de sub peak, metod folosit pentru
scanarea unui numr mai mare de geluri. nlimea
peak-ului depinde de distana materialului
parcurs prin gel.

 Electroforeza proteinelor
Proteinele se pot separa prin electroforez ca i
acizii nucleici. Suportul poate fi acetat de celuloz,
pentru proteinele din serul uman, sau hrtie, ntr-un
tampon de pH de 8,6.
Benzile corespunztoare proteinelor separate,
sunt vizualizate prin colorare cu un colorant
specific i printr-o scanare densiometric se obin
indicaii despre cantitatea relativ a proteinelor din
fiecare band separat.
Dei mobilitatea proteinelor depinde n special de
sarcina electric relativ a acestora, dimensiunea
proteinelor joac de asemenea un rol important i
aceasta contribuie desigur la poziia benzii
corespunztoare moleculei de globulin.

 Electroforeza proteinelor n gel de poliacrilamid

Gelul de poliacrilamid se poate folosi n locul
acetatului de celuloz sau al hrtiei pentru separarea
proteinelor native.
Un astfel de gel este folosit n mod obinuit n
prezena dodecil sulfatului de sodiu (SDS).
n acest caz proteinele oligomerice (alctuite din
cteva uniti polipeptidice) se pot separa n
subunitile lor individuale.
Proteinele se separ ntr-o soluie SDS 1%.
Acest detergent desface majoritatea legturilor dintre
proteine i dintre acestea i lipide.
Pentru a desface i punile disulfurice, se adaug
foarte des i 2-mercaptoetanol.

 Mobilitatea electroforetic a majoritii proteinelor (dar

nu i a glicoproteinelor), depinde de dimensiunea lor,
deoarece sarcina negativ adus de moleculele SDS
legat de protein este mult mai mare dect sarcina
net a proteinei nsi.
O distribuie specific (pattern) de benzi se obine la
colorarea gelului cu Albastru Comassie.
Gelul de agaroz poate fi folosit n locul celui de
poliacrilamid n cazul proteinelor mai mari sau pentru
a obine o separare diferit n absena SDS.
Se poate aplica metoda PAGE bidimensional,
folosind condiii de lucru diferite de cele dou direcii
de migrare: de exemplu un gradient constant de pH
(pH 4-7%) pe o direcie i un pH 11-14%poliacrilamid
n cealalt direcie.