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High Resolution

Melting (HRM)

¿Que es HMR?

Diferencias de metilación en

¿Que es HMR? Diferencias de metilación en varios loci. Características en función de su comportamiento de

varios loci.

Características en función de su comportamiento de fusión.

Análisis de la fusión

Técnica
Técnica
https://www.qiagen.com/us/resources/technologies/hrm/principle%20of%20hrm %20technology/#HRM technology description

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%20technology/#HRM technology description

Principio de HRM

Principio de HRM https://www.qiagen.com/us/resources/technologies/hrm/principle%20of%20hrm %20technology/#HRM technology description

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%20technology/#HRM technology description

Mezcla PCR-HRM

Mezcla PCR-HRM

Especificaciones

Primers que permiten la amplificación específica de diseño. Realizar una búsqueda

BLAST para asegurar la unión

cebador específico. Compruebe

similitud con otras secuencias

conocidas con BLAST.

Los primers deben ser 18-30 nucleótidos de longitud.

La temperatura de fusión de los primers se puede calcular

utilizando la fórmula: T m = 2 ° C x (número de [A + T]) + 4 ° C x (número de [G + C])

Evitar desajustes entre el

extremo 3’ del primer y el molde

diana

Siempre que sea posible, con pares de primers de Tm similar.

Evitar secuencias complementarias dentro de primers y entre los pares de

primers.

La temperatura de fusión deben ser de al menos 56 ° C.

Los primers deben tener un contenido de GC de 40-60%.

Asegúrese de secuencia del primer es única para su secuencia molde.

Cicladores

Rotor-Gene Q

Applied Biosystems 7500, 7900, ViiA 7 cyclers

Bio-Rad (CFX96 and 384)

Roche Lightcycler 480

LightScanner System (IdahoTechnology Inc.)

Eco Real-Time PCR System (Illumina)

Curva de fusión clásica Vs

HRM.

Curva de fusión clásica Vs HRM.

Técnica en artículos

Técnica en artículos

PCR Tiempo Real

Vol final

15 μl

(CFX96- BioRad)

95º- 2 mins

Precision melt supermix (BioRad)

7.5 μl

45 ciclos 95º- 10 seg c/u

Primers

400 nM c/u

54º - 30 seg 72º- 10 seg

DNA convertido por Bisulfito

20 nM

HRM 95º- 30 seg 60º- 1 min

70º- 10 seg… 90º aumentando 0.2º

PCR Tiempo Real

(LightCycler 96- Roche)

95º- 2 mins

Precision melt supermix (BioRad)

  • 20 μl

70 ciclos 95º- 10 seg c/u

Primers

250 nM

56º - 30 seg 72º- 10 seg

DNA convertido por Bisulfito

  • 25 ng

HRM

65º…95º aumentando

0.04%