High Resolution

Melting (HRM)
 Que es HMR?

Diferencias de
metilacin en
varios loci.

Caractersticas
en funcin de su Anlisis de la
comportamiento fusin
de fusin.

Tcnica
https://www.qiagen.com/us/resources/technologies/hrm/principle%20of%20hrm
%20technology/#HRM technology description
 Principio de HRM

https://www.qiagen.com/us/resources/technologies/hrm/principle%20of%20hrm
%20technology/#HRM technology description
Mezcla PCR-HRM
 Especificaciones
Primers que permiten la
amplificacin especfica de
diseo. Realizar una bsqueda La temperatura de fusin deben
Los primers deben ser 18-30
BLAST para asegurar la unin
nucletidos de longitud. ser de al menos 56 C.
cebador especfico. Compruebe
similitud con otras secuencias
conocidas con BLAST.

La temperatura de fusin de los

primers se puede calcular
utilizando la frmula: T m = 2 Siempre que sea posible, con Los primers deben tener un
pares de primers de Tm similar. contenido de GC de 40-60%.
C x (nmero de [A + T]) + 4
C x (nmero de [G + C])

Evitar secuencias
Evitar desajustes entre el Asegrese de secuencia del
complementarias dentro de
extremo 3 del primer y el molde primer es nica para su
primers y entre los pares de
diana secuencia molde.
primers.
 Cicladores
Rotor-Gene Q
Applied Biosystems 7500, 7900, ViiA 7 cyclers
Bio-Rad (CFX96 and 384)
Roche Lightcycler 480
LightScanner System (IdahoTechnology Inc.)
Eco Real-Time PCR System (Illumina)
Curva de fusin clsica Vs
HRM.
Tcnica en artculos
PCR Tiempo Real Vol final 15 l
(CFX96- BioRad)
95- 2 mins Precision melt supermix 7.5 l
(BioRad)
45 ciclos 95- 10 seg c/u Primers 400 nM c/u
54 - 30 seg DNA convertido por 20 nM
72- 10 seg Bisulfito
HRM
95- 30 seg
60- 1 min
70- 10 seg 90
aumentando 0.2
PCR Tiempo Real
(LightCycler 96- Roche)
95- 2 mins Precision melt supermix 20 l
(BioRad)
70 ciclos 95- 10 seg c/u Primers 250 nM
56 - 30 seg DNA convertido por 25 ng
72- 10 seg Bisulfito
HRM
6595 aumentando
0.04%