La cromatografa liquida de alta eficiencia en

la separacin de triglicridos de grasas de

animales complejas

METODOS MODERNOS DE ANALISIS DE ALIMENTOS

Prof: HUGO OJEDA ELIZARRAS

ERENDIRA ITZEL MURGUIA AGUILAR

JAZMIN ALEJANDRA MERCADO MAGAA
ESTEFANI DE MONSERRAT PAHUAMBA VICENTE
 INTRODUCCION
Los trigliceridos son parte de las fracciones lipidicas mas abundantes y
complejas.

Por esa razon es importante la determinacion de sus especies

moleculares y la posicion en la que se situa.

La recnica mas comun es cromatografia liquida de alta eficacia utilizando

columnas de reverza..
 FACE MOVIL
La eleccion de la face movil es fundamental para el analisis

Para esta se utiliza el ACETRONITRILO que es el mas ideoneo para ser

utilizado como disolvente principal .

Con este se lleva mejor la seoaracion de los pares criticos.

se ha estabkecido que para tener la eficacia optima de la columna se debe

disolver los TGS , y deven de ser de bajo peso molecular.
 FACE MOVIL
Para mejorar la solubiludad de los compuestos y proporcionar
cambios de polaridad .
Se devera agregar un disolvente secundario denominado
MODIFICADOR ORGANICO .
Estas se llevara acabo con elucion isocratica.En excepcin para
grasas complejas se debe utilizar gradiente
 FACE MOVIL
Incluso es posible ir modificando el
contenido de la fase mvil en uno u otro componente de
manera exponencial. De esta forma, es posible resolver
en un mismo cromatograma TGs de distinto NC, as
como muchos de los considerados pares crticos
 DISOLVENTE
El disolvente de la muestra adquiere importancia cuando es necesario
solubilizar TGS con grandes diferencias de polaridad.

Ademas el disolvente debe permitir el contacto entre soluto y face esrtacionaria .

DISOLVENTE :Cloroformo , Hexano ,

El acetona no es el adecuado para grasas saturadas de alto peso M.

 Detectores
Guando se utiliza elucin isocrtica, los detectores de ndice de refraccin (IR)
Los detectores de ultravioleta (UV), son compatibles con gradientes, pero no con algunos de los
disolventes ms utilizados para separar TGs, puesto que absorben en la misma regin del
espectro que stos.
Detector de difusin de luz evaporative (ELSD) ha propiciado un gran avance en la deteccin de
TGs. Dado que su respuesta es simplemente proporcional a la masa del analito.
Los detectores descritos tienen la desventaja de la identificacin de los picos cromatogrficos, que
se evita utilizando como detector un espectrmetro de masas. Mediante la combinacin de un
sistema de HPLC y un espectrmetro de masas de ionizacin qumica a presin atmosfrica se
pueden obtener datos relativos al peso molecular de los TGs
 Identificacin de Especies Moleculares

la dificultad que existe an hoy en da para disponer de un equipo integrado de HPLC-

espectrmetro de masas, se han concebido otros sistemas para la prediccin de la
identidad de los picos cromatogrficos.
el factor de capacidad (k') y los valores de NP de los TGs. Estimaron tericamente el
Nmero Equivalente de Carbonos (NEC) para TGs insaturados.
El NEC da cada TG en la muestra se define como el NEC del TG saturado hipottico.
El comportamiento de los triglicridos en H PLC en fase inversa no acuosa dependa
no slo del NC y ND, sino tambin del nmero de cidos grasos insaturados en la
molcula (NAI),
 Anlisis Estereoespecfico

La metodologa de anlisis por HPLC, que permite conocer la distribucin estereoespecfica de los
cidos grasos, utiliza mono y diglicridos como sustrato de anlisis. Estos glicridos parciales se
obtienen tras la hidrlisis de los TGs, que generalmente se realiza mediante la reaccin de Grignard.
Los productos obtenidos son posteriormente analizados por HPLC utilizando columnas de fase
normal o reversa. La combinacin de este anlisis junto con la composicin en cidos grasos
obtenida por cromatografa de gases permite el clculo de las posiciones estereoespecficas de los
TGs de una determinada grasa.
HPLC en fase quiral. Esta fase estacionaria presenta molculas quirales adheridas a la slice, lo que
evita tener que utilizar derivados diasteroisomricos.
Desventajas, como altos tiempos de retencin y pobre resolucin. Este mtodo separa los diglicridos
1,2 de los 1,3, que posteriormente deben ser analizados mediante cromatografa de gases para
determinar su composicin en cidos grasos.
 COMPOSICISION TRIGLICERIDICA DE LAS
GRASAS LACTEAS.

Los aceites de pescado se conocen por su alto contenido en cidos grados poliinsaturados de cadena larga de la
serie n-3. De entre stos, se sabe que los cidos eicosapentaenoico (G20:5, n-3) y docosahexaenoico (C22:6, n-3)
son los que poseen una mayor actividad favorable para la salud, ya que se relacionan con descensos en la
mortalidad debida a enfermedades coronarias (Shekelle, 1985, Kestin, 1990). Cada uno de estos dos cidos grasos
se encuentra en el pescado en proporciones entre el 6% y el 15% aunque en general el contenido de cido
eicosapentaenoico (G20:5, n-3) es superior. El resto del elevado nmero de cidos grasos poliinsaturados se
encuentra generalmente por debajo del 5%.
Los aceites de pescado se conocen por su alto contenido en cidos grados poliinsaturados de
cadena larga de la serie n-3. De entre stos, se sabe que los cidos eicosapentaenoico (G20:5,
n-3) y docosahexaenoico (C22:6, n-3) son los que poseen una mayor actividad favorable para la
salud, ya que se relacionan con descensos en la mortalidad debida a enfermedades coronarias
(Shekelle, 1985, Kestin, 1990). Cada uno de estos dos cidos grasos se encuentra en el
pescado en proporciones entre el 6% y el 15% aunque en general el contenido de cido
eicosapentaenoico (G20:5, n-3) es superior. El resto del elevado nmero de cidos grasos
poliinsaturados se encuentra generalmente por debajo del 5%.
 Cromatograma de triglicridos de la grasa de queso Idiazabal mediante H PLC. Separacin llevada a cabo a 30 C,
empleando dos columnas Nucleosil 120C-18 (3 ^im, 200 x 4.6 mm) dispuestas en serie. Gradiente de acetona en
acetonitrilo 0-35 % de acetona en 50 min., isocrtico 20 min, aumentando a 80 % de acetona en 75 min e isocrtico los
ltimos 10 min. Disolvente de inyeccin n-hexano, 10 |il. PN = nmero de particin; 18 = patrn interno (triestearina).
(Njera et al., Chromtogr. 1998, 47:576-579).
Los estudios anteriores confirman que la leche de invierno se caracteriza por presentar mayores contenidos de
TGs con cidos grasos saturados, de cadena corta y media, y menores contenidos de TGs con cidos grasos
insaturados y cadena larga, que la leche de verano. Por otra parte se ha observado, en general, que la distribucin
posicional de los cidos grasos en los TGs permanece prcticamente constante durante los meses del ao.

COMPOSICIN TRIGLICERDICA DEL

ACEITE DE PESCADO
Del total de lpidos, los TGs constituyen la mayor fraccin del aceite de pescado, de la cual un 11%
aproximadamente corresponde a fosfolpidos (Bandarra et al., 1997). Entre estos ltimos el ms abundante es la
fos fatidilcolina, que se encuentra entre el 45 y el 60% del total dependiendo de las especies (Kuksis, A., 1976,
Wada, S. et al., 1979). Los aceites de pescado contienen una inmensa variedad de cidos grasos, sobre todo de
cadena media y alta, aunque generalmente se circunscriben a longitudes de cadena entre Cu y C24 tomos de
carbono
La cromatografa Ag+-HPLC separa las molculas en base a su grado de insaturacin, la distribucin de
los dobles enlaces dentro de la molcula, la configuracin y distribucin de los dobles enlaces dentro de
cada uno de los cidos grasos y la posicin estereoespecfica en que los cidos grasos se encuentran
unidos al glicerol. El mecanismo de separacin se basa en el establecimiento de enlaces dbiles entre los
iones de plata y los electrones n de los dobles enlaces de las molculas (Nikolova-Bamyanova, 1992).
As, Laakso et al., (1990) separaron hasta 26 fracciones del aceite de arenque y McGill y Moffat (1992),
recogieron 18 de hgado de bacalao y 19 de aceite de sardina. Las fracciones que se obtienen de este
modo contienen TGs con diferentes grados de insaturacin. La primera es aqulla compuesta por mol-
culas trisaturadas (SSS), a continuacin el orden de elucin es SSM, SMM, SSD, MMM, SMD, MMD, etc.,
donde S, M y D se refieren a cidos grasos saturados, monoinsaturados y diinsaturados,
respectivamente.
Cromatograma de trigicridos de aceite de pescado mediante HPLC. Separacin llevada a cabo a 40 C,
empleando una columna Spherisorb ODS-2 (3 |Lim, 250 x 4.6 rnm). Gradiente de acetona en acetonitrilo 20-45
% de acetona en 12 min y hasta 80 % en 58 min. Disolvente de inyeccin n-hexano, 10 ^il. M = cido mirstico.
14:0; P = cido palmtico. 16:0; S = cido esterico. 18:0; Po = cido palmitoleico. 16:1, n-7; O = cido oleico.
18:1, n- 9; E = cido eicosapentaenoico. 20:5, n-3. D = cido docosahexaenoico. 22:6, n-3 Trigicridos: PPP =
tripalmitoil-glicerol; PPD = dipalmitoil-docosahexenoii-glicerol; POS = palmitoil-oleoil-estearoil-glicerol, etc.
Los trabajos desarrollados hasta la fecha han registrado una amplia variedad de especies
moleculares de TGs en el hgado. Perona et al., (1998b) identificaron 31 especies mediante
RP-HPLC con detector lightscattering. Los cidos oleico (Gi8:i, n-9), linoleico (Ci8:2, n-6) y
palmtico (Ci6:o) componan los TGs mayoritarios: palmitoil-oleoil-linoleoil-glicerol (POL),
dioleoil-linoleoil-glicerol (OOL), palmitoil-dioleoil-glicerol (POO), triolena (000), palmitoil-
dilinoleoil-glicerol (PLL), dipalmitoil-oleoil-glicerol (PPO) y oleoil-dilinoleoil-glicerol (OLL),
mientras que entre los minoritarios se identificaron TGs que contenan cido araquidnico
(020:4, n-6)ydocosahexaenpico (022:6, n-3).
 COMPOSICIN TRIGLICERIDICA DE LA GRASA
HEPTICA

La principal caracterstica de la grasa heptica es la elevada cantidad de fosfolpidos que contiene (60%), lo que dificulta
enormemente la determinacin de los TGs, ya que se impone la inclusin en el proceso de una etapa para su
aislamiento. Adems contiene una cantidad de colesterol que ronda el 8%, lo que deja el contenido de TGs alrededor del
30% aproximadamente, aunque depende en gran medida de la dieta (Muriana et al., 1992, Perona y Ruiz-Gutirrez,
1998c). La composicin en cidos grasos del hgado, y por tanto la composicin en TGs, es en buena parte reflejo de la
dieta. Por tanto, no se puede establecer una composicin nica de cidos grasos sin tener en cuenta qu dieta se ha
consumido. Una dieta rica en aceite de oliva por ejemplo, proporciona una gran cantidad de cido oleico (Ci8:i, n-9), que
se acumula en el hgado, dando como resultado hasta casi un 30% de este cido graso respecto al total (Perona et al.,
1998a,b,c).
Existen pocos estudios relativos al estudio de las posiciones estereoespecficas
en que los cidos grasos que componen los TGs del hgado esterifican la
molcula de glicerol. Innis et al., (1996) comprobaron en el hgado de cerdo, que
al contrario de lo que sucede en el tejido adiposo de este animal, el cido
palmtico (Ci&o) no ocupa la posicin sn-2. Efectivamente, esta posicin central
es ocupada por los cidos oleico (Ci8:i, n-9) y linoleico (Ci8:2, n-6).
Cromatograma de triglicridos de la grasa heptica mediante H PLC. Separacin llevada a cabo a 40 C,
empleando una columna Spherisorb ODS-2 (3 |Lim, 250 x 4.6 mm). Gradiente de acetona en acetonitrilo 20-45 %
de acetona en 4 min y hasta 80 % en 36 min. Disolvente de inyeccin n-hexano, 10 ^il. M = cido mirstico. 14:0; P
= cido palmtico. 16:0; 5 = cido esterico. 18:0; Po = cido palmitoleico. 16:1, n-7; O = cido oleico. 18:1, n-9; L =
cido linoleico. 18:2, n-6; Ln = cido linolnico. 18:3, n-3. Trigicridos: PPP = tripalmitoilglicerol, PPL = dipalmitoil-
linoleoil-glicerol; POS = palmitoil-oleoil-estearoil-glicerol, etc.
 CONCLUSION

Actualmente la tcnica de HPLC en fase reversa, es la que mejores resultados ofrece para el anlisis de las especies
moleculares de TGs en grasas tan complejas como las descritas en el presente artculo. Mediante esta tcnica,
utilizando fases mviles, en
general compuestas por gradientes de acetona en acetonitrilo, y con deteccin light-scattering, es posible separar en
molculas individuales los TGs de la grasa lctea, el aceite de pescado y la grasa heptica, reduciendo al mnimo, e
incluso eliminando, el nmero de pares crticos sin resolver. Sin embargo, en la mayora de los casos es necesaria la
participacin de otras tcnicas, como la cromatografa de gases o la espectrometra de masas para la identificacin de
los picos cromatogrficos. Por otra parte, an queda largo plazo para el establecimiento de un mtodo simple y rpido
que permita separar ismeros posicionales de TGs.