DNA complementario (cDNA)

Es el DNA que se ha sintetizado a partir de

mRNA y la enzima transcriptasa reversa.
-La Ingeniería Genética es una
técnica que trata de la
manipulación de los genes y de
sus productos.
Sus métodos de trabajo son
también conocidos como técnicas
del ADN recombinante.
 Etapas de la tecnología del ADN recombinante
En la tecnología del ADN recombinante podemos diferenciar varias etapas:

• Localización del fragmento del ADN en que se halla el gen que se quiere clonar.

• Preparación de un vector que sirva de vehículo para el gen en cuestión (por

ejemplo, un virus o un plásmido).

• Fragmentación de ambos ADNs por enzimas de restricción.

• Formación del ADN recombinante (entre ambos ADNs) por enzimas ligasas.

• Introducción del vector con ADN recombinante en la célula anfitriona (huésped).

• Propagación del cultivo celular por proliferación de la célula anfitriona.

• Detección y selección de clones recombinantes de entre las células del cultivo.

-Las técnicas del ADN recombinante,
básicamente, consisten en lo siguiente:
a)se toman fragmentos de ADN de distintos
organismos y se unen 'in vitro' ('recombinación in
vitro'); el ADN que resulta se conoce como ADN
recombinante.
b)el ADN recombinante se introduce en otras
células (generalmente bacterias), en las cuales
se logra la expresión de sus genes
 VECTORES DE CLONACIÓN

Los vectores de clonado, son los agentes transportadores

capaces de introducir el ADN en las células hospedadoras.

Los vectores de clonación son pequeñas moléculas de ADN,

que tienen capacidad para autorreplicarse dentro de las
células hospedadoras.

Se utilizan con frecuencia dos tipos de vectores de clonación:

plásmidos y virus.
Plásmidos. Son moléculas de ADN circular, con un
tamaño menor que el del cromosoma. Se replican con
independencia del cromosoma bacteriano ya que tienen su
propio origen de replicación.

Tenemos un gen(color rojo) que interesa insertar en un

plásmido (color turquesa)
Además del origen de replicación, los
vectores de clonación deben llevar
otros genes denominados marcadores,
que sirven para identificar las células
que contienen el vector de clonación.

Se suelen utilizar como marcadores,

genes de resistencia a antibióticos y
genes de bioluminiscencia.
La Ingeniería Genética nació como
consecuencia del descubrimiento de que
algunas bacterias resistentes a los fagos
tienen unas enzimas que cortan en trozos
pequeños las moléculas de ADN extrañas..

Estas enzimas se conocen como enzimas

de restricción (son del tipo de las
endonucleasas y se conocen más de 200) .
 Enzimas de restricción

Premio Nobel 1978 Medicina

Werner Arber.
Daniel Nathans.
Hamilton O. Smith.
PAPEL DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

a)se utilizan para obtener ‘fragmentos de

restricción’ (pequeños segmentos de ADN),
fáciles de analizar y manipular.

b)cortan el ADN por sitios específicos, llamados

secuencias de reconocimiento (formadas por
cuatro u ocho pares de bases, que, en la
bacteria original, están protegidas para evitar
que se destruya su propio ADN)
Preparando ADN Recombinante

5’ G A A T T C

3’ C T T A A G

one DNA fragment another DNA fragment

5’ G A A T T C 3’

3’ C T T A A G 5’
 nick
5’ G A A T T C 3’

3’ C T T A A G 5’
nick

DNA ligase action

G A A T T C

C T T A A G
Métodos de introducción del vector.
El siguiente paso será introducir el vector de clonación que
contiene el gen que se quiere clonar en la célula
hospedadora, para que ésta, al multiplicarse, origine un clon
celular que lleve el gen concreto.
Existen varios métodos que dependerán del tipo de célula
fundamentalmente.
En bacterias (células procariotas), mediante:

- TRANSFORMACIÓN
-
Transformación.
Ocurre espontáneamente en ciertos tipos de bacterias y se
consigue artificialmente sometiendo a la célula bacteriana a
tratamientos físicos y químicos.
La célula capta moléculas de ADN que se encuentran en el
medio externo, las introduce en su interior y las incorpora a
su genoma.
Al clonar un gen en un vector
permite la amplificacion del
gen.
 Primer fármaco producido por ingeniería
genética aprobado por FDA

En 1982 se produjo el primer

fármaco hecho por ingeniería
genética

Se produjo insulina humana

mediante bacterias modificadas
por tecnología del DNA
recombinante
.
La presencia de intrones en los genes de
Eucariontes crea problemas para expresar estos
genes en bacterias

Para expresar genes de eucariontes en bacterias, se

usa DNA complementario (cDNA)
Producción de InsulinaHumana
Aislamiento a partir del mRNA (ya no
tiene intrones): uso de la transcriptasa
inversa que hace cDNA
 Recombinant Insulin
Clone the human cDNA (spliced gene)
Transfer the plasmid to bacteria (E. coli)
 Selección de las bacterias
recombinantes

Es la parte mas compleja del proceso

 Route to the Production by Bacteria of Human Insulin

Una célula con el

plámido recombinante

Fermentador usado para

crecer las bacterias.
Las etapas finales son recolectar las bacterias , romper las
células, y purificar la insulina expresada
 Los organismos geneticamente
modificados estan transformando la
agricultura
El vector mas comunmente usado para
introducir nuevos genes en células de plantas
es un plásmido de la bacteria
Agrobacterium tumefaciens llamado
plásmido Ti.
Agrobacterium
tumefaciens

DNA containing the Plant cell

gene for a desired trait

Ti 1 2 3
plasmid
The gene is The The plant
inserted into recombinant cell grows
the plasmid. plasmid is into a plant.
Recombinant introduced DNA carrying
Restriction Ti plasmid the new gene A plant with
into a
site the new trait
plant cell.
Daño causado por virus PRS en un campo
de papayas en Hawai 1992-1997.
 Un ejemplo
Científicos de la Universidad de Hawai fueron
capaces de crear, mediante ingeniería genética,
plantas de papaya, resistentes al virus PRV

Actualmente, la mayoría de las papayas de Hawai

son organismos geneticamente modificados