Trabajo Práctico

N°3 y N°4

Informe de Laboratorio

Integrantes: Diaz Micaela, Abbattista Pablo,

Bevilacqua Agustin
 Aislamiento de ADN
genómico de
Saccharomyces cerevisiae
 Resumen
Aislamiento de ADN de la levadura Saccharomyces Cerevisiae:

• Ruptura de la pared celular por ciclos de

congelamiento/descongelamiento.

• Separación en alcohol.

• Reconocimiento y Evaluación de la extracción por medio del la

electroforesis en geles de agarosa.

Se logró evaluar y conocer dicha técnicas de extracción. Sin

embargo no se pudo confirmar el éxito de la extracción por fallas
en la electroforesis.
 Objetivos
• Aislamiento de ADN de la levadura
Saccharomyces Cerevisiae

• Reconocimiento y Evaluación de la extracción por

medio del la electroforesis en geles de agarosa

• Conocer los métodos de extracción, purificación y

reconocimiento de ADN
 Fundamento Teórico
ACIDO DESOXIRRIBONUCLEICO (ADN)
• Molécula formada por dos cadenas de
polinucleótidos unidas por puentes de hidrogeno.
• Los nucleótidos están formados por un grupo
fosfato, una azúcar desoxirribosa y una base
nitrogenada, la cual puede ser: Timina, Adenina,
Guanina o Citosina.
• En las células procariotas el ADN se encuentra
disperso en el citoplasma, y en las células
eucariotas está ubicado dentro del núcleo.
Levadura Saccharomyces
Cerevisiae
La levadura
Saccharomyces
cerevisiae es un hongo
unicelular, el cual es
utilizado como modelo
de estudio de células
eucariotas. Una de las
ventajas de la
utilización de estos
organismos es su
sencilla manipulación
celular, molecular y
genética.
 Lisis celular

Métodos no físicos
Métodos físicos
• Ruptura por ciclos de
• Ruptura mecánica
congelamiento /
(Bolillas de vidrio)
descongelamiento.
• Homogeneizadores • Detergentes: SDS, CTAB
• Sonicación • EDTA: quelante iones
• Digestión enzimática: Proteinasa K,
zimolasa ó liticasa
 Procedimiento

• Extracto de levadura • Agitación a 30 º C

• Peptona • Cultivo YPD crecido de
• Glucosa levadura
• Se transfieren 1,5 ml de cultivo a un
tubo Eppendorf
• Centrifugación 5 minutos a 14000
RPM
• Se agregan 200 μL de buffer de lisis
(al pellet)
• Agitación en Vórtex
• Incubación a -80 ªC durante 2
minutos
• Incubación a 100 ªC durante 1
minuto
 • Se homogeniza y se agregan
200 μL de cloroformo
• Agitación en Vórtex
• Se centrifuga 3 minutos a 14000
RPM
• Se transfiere a un nuevo tubo
la parte superior acuosa
ADN • Se agregan 400 μL de etanol y
se mezcla
Proteínas • Se incuba 5 min a -20 ª C, se
centrifuga 5 min y se extrae el
liquido dejando precipitado el
ADN
Cloroformo con • Luego se agregan 500 μL de
restos de etanol al 70% , se centrifuga
membranas, nuevamente 5 min
lípidos • Se descarta el liquido dejando
el ADN precipitado
Electroforesis en gel de Agarosa
Revelado de ADN con
azul de metileno
 Resultados
• Visualización de ADN sembrado en el gel

• Podría haber algunos restos de ARN en el revelado

• En el revelado se visualiza algunas líneas mayores

(fragmentos de ADN de igual peso molecular)
 Conclusión
• Proceso de extracción de ADN mediante un
método simple y rápido

• Posibles errores en el sembrado

• Se logró evaluar y conocer las técnicas de

extracción, sin embargo no se pudo confirmar el
éxito de la extracción por fallas en la electroforesis.
Extracción de lípidos
 Resumen
Extracción de lípidos totales de S. cerevisiae por el método
de Bligh & Dyer

Análisis cualitativo de los lípidos mediante cromatografía en

capa delgada (CCD) en placa de silica gel

Se logró evaluar y conocer dichas técnicas. Se logró confirmar el

éxito de la extracción al revelarse la placa de silica gel.
 Objetivos

• Extracción de lípidos por el método de Bligh &

Dyer

• Análisis cualitativo de los lípidos mediante

cromatografía en capa delgada (CCD)

• Conocer los métodos mencionados

 Fundamento Teórico
LIPIDOS
• Biomoléculas orgánicas (no son polímeros)
• No polares
• Insolubles en el agua, Solubles en los solventes orgánicos
• Formadas por CARBONO, HIDRÓGENO, OXÍGENO y en
ocasiones FÓSFORO, NITRÓGENO y AZUFRE
• Material fundamental de todas las membranas
celulares
• Mayor reserva de energía de los organismos
 Método de Bligh & Dyer
• Levadura Saccharomyces Cerevisiae
• Rápido y simple
• Homogenización de la muestra con mezcla de
solventes
• Cloroformo : Metanol : Agua

1 2 0,8
• Se generan sistemas monofásico – bifásico para la
extracción de lípidos
 • Se transfiere 1,5 mL de cultivo
Procedimiento •
crecido (pellet)
Se agregan 600 μL de Metanol
• Se agita en Vórtex
• Se adhieren 300 μL de
Cloroformo
• Se pone en agitador durante
30 min
• Se obtiene un Sistema
Monofásico
• Se agregan 300 μL de
Cloroformo
• Se mezcla y se centrifuga 5
minutos
• Se quita el sobrenadante
• Se agregan 300 μL de agua
destilada y se centrifuga 5 min
• Se obtiene un Sistema Bifásico:
Fase Metanólica y Fase
Cloróformica
Finalmente se extrae la fase inferior donde se
encuentran los lípidos (Fase Clorofórmica)
Cromatografía Capa
Delgada
• Se equilibra la placa con solvente de desarrollo
cloroformo:metanol:agua (65:25:4), y se deja secar
con aire caliente.

• Se siembran la muestra de lípidos junto con los

patrones a comparar en la línea de siembra sobre
una placa de silica gel.

• Se coloca la placa en la cuba y se desarrolla con el

solvente de desarrollo(diclorometano).
Revelados: H2SO4 5% en
etanol y vapores de yodo
 Resultados
• Se obtuvo que el patrón Nº1 resultó muy polar y el
Nº2 menos polar.

• Las muestras no se llegan a apreciar de manera

considerable, pero corrieron hasta la mitad de la
placa, con RFs aproximados a 0,5. Estableciendo
una similitud con el patrón Nº 2
 Conclusión
• Se podría decir que los lípidos totales de levadura
son de carácter medianamente polar comparados
con los 2 patrones.

• Se consideró falta de concentración de la muestra

para apreciar en forma mas nítida los resultados.

• Se determinó que el método de Bligh y Dyer es

eficaz, rápido y sencillo para la separación de
lípidos totales