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n
(
v
)
Km
Vmax
Vmax/2
La Km es la concentracin de sustrato
donde se obtiene la mitad de la Vmax
Concentracin de Sustrato [S]
V
e
l
o
c
i
d
a
d
d
e
l
a
r
e
a
c
c
i
n
(
v
)
Km
Vmax
Vmax/2
A mayor Km, menor es la afinidad de la enzima por el sustrato
A menor Km mayor es la afinidad de la enzima por el sustrato
Representacin directa
s
0 20 40 60 80 100
v
0
20
40
60
80
100
K
m
V
max
v
V s
K s
mx
m
=
+
Representacin recproca doble
(Lineweaver - Burk)
1/s
-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6
1/v
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
1 1 1
v
K
V s V
m
mx mx
= +
-1/K
m
1/V
max
Representacin Lineweaver-Burke
Supongamos que una enzima con dos centros activos y
un peso molecular 10.000, cataliza la reaccin de un sustrato.
Determinar
a) Velocidad Mxima
b) Km
c) Actividad mxima especfica
d) Concentracin en el centro activo
e) Nmero de recambio
Si se agrega 2mg de la protena por Litro, se encontr los siguientes valores:
[S] Velocidad de reaccin
mM M/min
3 18
4 22
9 40
13 50
25 67
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 5 10 15 20 25 30
[S] Velocidad de reaccin 1/ [S] 1/v
mM M/min
3 18 0,33 0,055
4 22 0,25 0,045
9 40 0,11 0,025
13 50 0,076 0,02
25 67 0,04 0,015
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35
1/km
1/v
a) Vmx = 1/0,01 Vmx = 100 M/min
b) Km = 1/ 0,075 Km= 13,33 M
c) Actividad mxima especfica = Vmx / [E]
100 M/min / 2mg = 50M/min.mg
d) Concentracin en el centro activo = No. Subunidades . ([E]) / P.M
C.C.A 2(2x10-4g) / 10.000g/mol
4x10-8 mol
e) Nmero de recambio = Vmx / C.C.A
100 M/min / 4x10-8 mol
2,5EX 9 M/min.mol
El "nmero de recambio o Kcat, es una relacin de afinilidad que tiene la enzima
con el sustrato. Muestra la eficiencia impresionante de la catlisis enzimtica.
Representa las moles de sustrato atacados por un mol de enzima
en una unidad de tiempo determinada, generalmente un minuto.
Unidad Internacional= cantidad de enzima necesaria para transformar un micromol
de sustrato por minuto. 1 U= 1 mol/min.
Definicin Actividad Enzimtica
Es el nmero de moles de sustrato que reaccionan para
formar producto, por mol de enzima y por unidad de
tiempo. Esto supone que la enzima est plenamente
saturada con sustrato y por tanto que la reaccin se
efecta con su mxima rapidez
El ndice de recambio muestra la eficiencia
impresionante de la catlisis enzimtica
Clculo de Actividad Enzimtica
La velocidad de reaccin catalizada por 0,1ml
de una dilucin 1:100 de Fosfatasa Alcalina es
0,3umoles / min. de producto. Cul es su
actividad enzimtica?
0,1ml-------- 0,3umoles producto / min.
1,0ml------------3,0umoles producto / min.
dil 1:100-------------300umoles producto / min.
Respuesta: 300U/ml
En el efecto de la temperatura hay dos componentes:
1. Aceleracin de la reaccin segn la ecuacin
de Arrhenius
k = A exp (-E
a
/RT)
2. Desnaturalizacin trmica de la protena
ORGANISMOS TERMFILOS
Son organismos que viven a altas t y realizan
sus reacciones enzimticas a estas altas t
Ejemplos son los que viven en las aguas
termales
Es tema de investigacin el aislamiento de las
enzimas de estos organismos para desarrollar
procesos industriales en condiciones ms
extremas
Inhibicin enzimtica
Inhibidor:
Efector que hace disminuir la actividad enzimtica, a travs de
interacciones con el centro activo u otros centros especficos
(alostricos).
Esta definicin excluye todos aquellos agentes que inactivan a
la enzima a travs de desnaturalizacin de la molcula enzimtica
De esta forma, habr dos tipos de inhibidores:
I. Isostricos: ejercen su accin sobre el centro activo
II. Alostricos: ejercen su accin sobre otra parte de la
molcula, causando un cambio conformacional con
repercusin negativa en la actividad enzimtica.
Inhibicin enzimtica
isostrica
Los inhibidores isostricos pueden ser de dos tipos:
1. Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima libre,
con el complejo enzima-substrato o con ambos:
E + I EI
2. Inhibidor irreversible: modifica qumicamente a la enzima:
E + I
E
ES + I
ESI
Inhibicin reversible
(a) El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre,
impidiendo la fijacin del substrato: Inhibicin Competitiva
(b) El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo
haga o no el substrato; el inhibidor, por tanto, no impide la
fijacin del substrato a la enzima, pero s impide la accin
cataltica: Inhibicin No Competitiva
(c) El inhibidor se fija nicamente al complejo enzima-substrato
una vez formado, impidiendo la accin cataltica; este tipo
se conoce como Inhibicin Anticompetitiva
Inhibidores Competitivos
Compiten con el sustrato por el sitio activo
de la enzima
Se une solo a la enzima libre
V
mx
no se altera y K
M
cambia
Inhibicin competitiva
K
M
aparente es mayor que K
M
real
V
mx
no se modifica
Cuanto ms pequeo sea el valor de Ki mayor ser la potencia del inhibidor
Al aumentar la cantidad de SUSTRATO
el inhibidor competitivo es desplazado y se forma producto
E
ES
EI
I
S
E + P
Caractersticas:
- Las fijaciones de substrato e inhibidor son mutuamente exclusivas
- A muy altas concentraciones de substrato desaparece la inhibicin
- Por lo general, el inhibidor competitivo es un anlogo qumico del
substrato.
- El inhibidor es tan especfico como el substrato
Se define una constante de
equilibrio de disociacin del
inhibidor:
K
i
=
[E] [I]
[EI]
Km
Sin
inhibidor
Km
con
inhibidor
Sin inhibidor
Con inhibidor
El inhibidor competitivo
aumenta la Km
1/s
-0.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
1/v
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
-1/K
m
-1/(K
m
(1 + i/K
i
))
1/V
max
Inhibicin competitiva - Representacin recproca doble
Ejemplo Inhibidor Competitivo
cido succnico + FAD == cido fumrico
+ FADH
2
El inhibidor competitivo es el cido
malnico
Es un anlogo estructuralmente parecido
al cido succnico
cido Flico y Sulfanilamida
La sulfanilamida es un anlogo estructural
del cido p - aminobenzoico (PABA)
PABA es el punto de partida para la
sntesis de cido flico en las bacterias
El cido flico es una vitamina esencial
para la proliferacin (divisin) bacteriana
Sulfanilamida se usa en el tratamiento
algunas infecciones
Inhibidor competitivo
su estructura es similar a la del sustrato
No se forma producto
Inhibicin no-competitiva
Inhibidor No Competitivo
Se une a un lugar diferente del sitio activo
la enzima
Se une a la enzima libre y tambin al
complejo enzima-sustrato
Por accin del inhibidor disminuye la V
m
pero el valor de K
m
no se altera
E ES
EI
I
S
E + P
I
ESI
S
Inhibicin
No Competitiva
El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre E
y al complejo enzima-substrato ES; ni el complejo EI
ni el complejo ESI son productivos
Inhibicin acompetitiva
Inhibicin enzimtica
Inhibidor:
Efector que hace disminuir la actividad enzimtica, a travs de
interacciones con el centro activo u otros centros especficos
(alostricos).
Esta definicin excluye todos aquellos agentes que inactivan a
la enzima a travs de desnaturalizacin de la molcula enzimtica
De esta forma, habr dos tipos de inhibidores:
I. Isostricos: ejercen su accin sobre el centro activo
II. Alostricos: ejercen su accin sobre otra parte de la
molcula, causando un cambio conformacional con
repercusin negativa en la actividad enzimtica.
Inhibidor Irreversible
Malatin
Acetilcolinesterasa
Tripsina
Elastasa
Fosfoglucomutasa
Cocoonasa (larvas de
gusanos de seda
Fluorofosfato de diisopropilo
(DFP)