Parametri fondamentali della microscopia

La propriet fondamentale di un microscopio la possibilit di ottenere unimmagine ingrandita di un oggetto. Lingrandimento fornito da uno strumento ottico definito come il rapporto tra: Langolo sotto cui si vede un oggetto con lo strumento e langolo sotto cui si vede lo stesso oggetto senza strumento . Il rapporto tra la dimensione dellimmagine vista al microscopio e quella delloggetto.

40
10

Parametri fondamentali della microscopia

Lingrandimento da solo non basta, necessaria la capacit di distinguere i particolari: risoluzione

Parametri fondamentali della microscopia

Potere di risoluzione
Il potere di risoluzione di un sistema ottico consiste nella capacit di distinguere due punti delloggetto che stiamo osservando come due punti distinti fra di loro. Locchio umano ha un PdR = 0,1 mm Il microscopio ottico ha un PdR = 0,2 m R = 0,61 / AN
dove R = distanza minima fra due punti che il sistema ottico in grado di risolvere, = lunghezza donda del sistema di illuminazione impiegato, ed A N = apertura numerica dellobiettivo.

AN = n sen
dove n=indice di rifrazione del mezzo interposto fra lente ed oggetto; = langolo di accettazione della luce della lente frontale dellobiettivo

Anatomia di un microscopio
fotocamera o telecamera oculari revolver con obiettivi tavolino traslatore condensatore diaframma di campo

stativo fonte di illuminazione vite macrometrica e micrometrica

IL MICROSCOPIO OTTICO

Due lenti convergenti principali (in realt sistemi ottici): obiettivo forma unimmagine reale ingrandita delloggetto

oculare forma unimmagine virtuale ulteriormente ingrandita

Lobiettivo rappresentato da un doppio sistema di lenti convergenti che proietta limmagine ingrandita ed invertita delloggetto sotto osservazione alloculare in modo che questo possa "vederla" ed ingrandirla ulteriormente. La distanza della lente frontale dellobiettivo dal campione piuttosto piccola variando da 30 mm a 0,1 mm a seconda del suo potere di ingrandimento, in maniera inversamente proporzionale: maggiore il potere di ingrandimento minore la distanza di lavoro dellobiettivo.

Col microscopio ottico si possono ottenere fino a 1000 ingrandimenti.

Il binoculare d un ingrandimento di 10 volte (10x), ed dotato di un dispositivo di allargamento-restringimento della distanza dei due oculari. Il revolver degli obiettivi rotante e consta generalmente di 4 obiettivi ad ingrandimento crescente (4x, 10x, 40x e 100x). Lingrandimento finale dato dalla moltiplicazione dell ingrandimento dellobiettivo con quello delloculare.

I campioni da esaminare al microscopio ottico devono essere illuminati perch si possa formare una loro immagine visibile nelloculare e, di solito, questo viene ottenuto con "luce trasmessa", ovvero la luce attraversa i campioni stessi. Il condensatore un sistema di lenti posto al di sotto del tavolino traslatore del microscopio ed provvisto di un "diaframma di apertura" che permette di modificare lampiezza del cono di luce che da esso esce, adattandolo alla AN dellobiettivo in uso
lente del condensatore focalizza la luce incidente sul campione diaframma regola lintensit luminosa
La

fonte di illuminazione una radiazione con lunghezza donda relativamente lunga (visibile 400-700 nm)

Osservazione a contrasto di fase

Il microscopio a contrasto di fase si basa sull'incremento delle differenze di contrasto tra il campione da analizzare e il mezzo circostante, in modo tale da consentirne la visualizzazione senza ricorrere a metodologie di colorazione. Il principio alla base di questo tipo di microscopia che il campione, per esempio un preparato di cellule, ha un indice di rifrazione differente dal mezzo circostante e quando la luce lo attraversa viene deviata e ritardata. L'obiettivo del microscopio a contrasto di fase amplifica questo effetto e porta alla formazione di una immagine scura su campo chiaro. Nel microscopio a contrasto di fase le differenze di fase sono opportunamente amplificate in modo tale che l`intensita` sia percepibile dall`occhio umano.

Il microscopio a contrasto di fase viene usato per l`osservazione di cellule coltivate in vitro. Esso consente di evitare l`uso di coloranti o fissativi che possono alterare le caratteristiche in vivo delle cellule.

Un batterio (Lb. sakei), Contrasto di fase, 400x

Un lievito (S. cerevisiae), Contrasto di fase, 400x

Una muffa (G. candidum), Contrasto di fase, 400x

Microscopio a fluorescenza
La fluorescenza e` il fenomeno per cui alcune sostanze fluorescenti colpite da tale radiazioni emettono luce di maggiore e dunque visibili. Il preparato legato a fluorocromi, molecole in grado di emettere luce di una specifica lunghezza d'onda (quindi di un unico colore) quando eccitati con luce di una lunghezza d'onda inferiore

La sorgente luminosa e` una lampada a vapori di mercurio che emette radiazioni invisibili (ultravioletto, 200-400nm).

MICROSCOPIA ELETTRONICA

Il microscopio elettronico utilizza un fascio di elettroni e non di fotoni, come un microscopio ottico, poich i fotoni che compongono un raggio di luce posseggono un lunghezza donda molto maggiore degli elettroni: dato che il potere di risoluzione di un microscopio inversamente proporzionale alla lunghezza donda della radiazione che utilizza, usando elettroni si raggiunge una risoluzione parecchi ordini di grandezza superiore.

Microscopio elettronico a trasmissione (TEM)

Un po di storia...
Berlino 1931: Prof. Ernst Ruska (Nobel nel 1986), intuisce che un campo elettromagnetico funzionava come una lente per gli elettroni. 7 Aprile 1931: Ruska & coll del gruppo del Prof. Max Knoll ottengono la prima foto al micr. Elettronico (17.400 X) Nascita della Microscopia Elettronica 1933: E. Ruska sviluppa il vero prototipo di Microscopio Elettronico a Trasmissione (TEM) 1939: TEM disponibile sul mercato

Microscopio elettronico a scansione (SEM)

Un po di storia...
Tra il 1935 e 1938: M. Knoll ottiene le prime immagini relative alla topografia della superficie di un campione colpito da un fascio di elettroni. Basi per la costruzione del primo Microscopio Elettronico a Scansione (SEM). 1938: in Germania, M. von Ardenne progetta il primo strumento

1965 il SEM diventa commercialmente disponibile

IL MICROSCOPIO ELETTRONICO
A trasmissione (TEM): gli elettroni attraversano il preparato

A scansione (SEM): gli elettroni incidono sulla materia, determinando l'emissione di elettroni secondari che, raccolti, forniscono immagini dettagliate della superficie degli oggetti dei quali risulta una visione tridimensionale.

TEM
Studi ultrastrutturali ed alterazione delle strutture interne di cellule o tessuti in seguito a trattamenti farmacologici od in particolari stati fisiologici o patologici degli stessi

Localizzazione di molecole preventivamente marcati

Osservazione di virus

interne

cellule

tessuti

SEM
Morfologia di superficie ed alterazioni della stessa in seguito a trattamenti farmacologici od in particolari stati fisiologici o patologici di cellule o tessuti Localizzazione di recettori di superficie preventivamente marcati

TEM
filamento (catodo) anodo

La sorgente luminosa sostituita da un fascio di elettroni accelerati nel vuoto. Le lenti sono sostituite da campi magnetici ed elettrici che hanno un effetto convergente sugli elettroni. Gli elettroni si associano ad una lunghezza d'onda molto pi piccola rispetto a quella dello spettro visibile; ci determina un aumento del potere risolvente fino a circa 10 . L'immagine fornita invisibile all'occhio umano, ma pu essere fotografata e raccolta su uno schermo fluorescente che emette luce visibile sotto l'urto degli elettroni provenienti dal preparato; essa risulta in bianco e nero con varie tonalit di grigio in corrispondenza della maggiore o minore trasparenza agli elettroni delle strutture cellulari.

condensatore preparato obiettivo

proiettore

schermo

Esempio di microfotografia elettronica al T.E.M.

S.E.M

Ingrandimento : da 10 a 200000 volte

Un fascio di elettroni primari, focalizzato da lenti elettroniche, viene inviato sul campione muovendolo, con un sistema generatore di scansione, cos da farlo scorrere sulla superficie dell'oggetto in esame. Il fascio di elettroni durante la scansione del campione colpisce la sua superficie generando degli elettroni secondari. La quantit e l'energia degli elettroni secondari retrodiffusi da ogni punto del campione colpito dal fascio elettronico dipendono dalla morfologia, oltre che dalla natura chimica, del campione in quel punto. Un rivelatore di elettroni secondari retrodiffusi provvede a raccogliere il segnale che viene acquisito da un sistema di generazione dell'immagine ed inviato su uno schermo, ove viene cos tracciata l'immagine del campione esaminato.

Potere di risoluzione: 200 Angstrom

Esempio di microfotografia elettronica al S.E.M.

Fasi principali della preparazione di campioni per la Microscopia Elettronica a Trasmissione

1) Prelievo
Il campione ottimale deve avere le minime dimensioni richieste per attuare unadeguata fissazione, disidratazione ed inclusione in resina

2) Fissazione
Ha lo scopo di immobilizzare tutti i componenti molecolari e macromolecolari dellarchitettura cellulare, provocando larresto istantaneo di tutte le attivit chimico-fisiche cellulari Fissativo di Karnovsky: paraformaldeide 8%, gluteraldeide 50%, tampone fosfato 0.1M
I fissativi sono veicolati da un opportuno tampone. Principali tamponi: a) Tampone fosfato (+ usato); b) Tampone cacodilato (sodio metil arsenato); c) Tampone veronal-acetato (altamente tossico)

2a) Post-Fissazione in Tetrossido di Osmio

3) Disidratazione
Ha lo scopo di allontanare completamente i fluidi presenti nel campione, per poterlo poi sottoporre ai procedimenti di inclusione

Passaggi: Etanolo 50% 10min 70% 10min 85% 10min 90% 10min 95% 10min 100% 2x20min

4) Trattamento con ossido di propilene ed Inclusione in resina Epon 812

La resina fornisce il sostegno necessario per tagliare il campione in fettine sottili. Si effettua una serie di passaggi in una miscela di ossido di propilene e resina epossidica per favorire la successiva impregnazione nella resina assoluta. Il trattamento in stufa a 60 C per almeno due giorni consente la polimerizzazione della resina.

5) Taglio con ultramicrotomo

2 Tipi di sezioni: A) Semi-fine ottico, colorandole con blu di toluidina, spessore 1-2m B) Fine elettronico, spessore 40-60nm

Taglialame: permette di preparare le lame di vetro con le quali vengono tagliate le semifini.

6) Colorazione delle semifini

Sezioni semifini 1m colorate con Blu di Toluidina 1% su piastra a 80C e osservate al microscopio ottico.

Immagini di semifini (1m)

al M.O.

7) Contrasto delle ultrasottili

Sezioni ultrasottili 60-80nm vengono
tagliate con lame di diamante e poste su retini. In seguito vengono contrastate

con acetato di uranile e citrato di

piombo e osservate al microscopio elettronico. Le sezioni di tessuto devono essere sottilissime per consentire il passaggio degli elettroni il cui potere di penetrazione molto basso.

Immunogold Similmente alle tecniche immunoistochimiche per la microscopia ottica, anche in microscopia elettronica si sfruttano le propriet degli anticorpi per localizzare determinati costituenti cellulari. Una delle tecniche pi diffuse limmunogold, che utilizza particelle sferoidali di oro colloidale, disponibili in diversi diametri (da 5 a 30 nanometri), che vengono coniugate con anticorpi specifici, in modo da andare a legarsi, nella sezione di tessuto, nella posizione occupata dagli antigeni. La posizione delle particelle direttamente rilevabile al microscopio elettronico, poich l'oro opaco agli elettroni e forma, quindi, un'ombra scura sull'immagine del campione. Le particelle d`oro vengono visualizzate come puntini neri sulla sezione.