(41) BASES MOLECULARES DE LA INGENIERIA GENTICA

JOSE ROBERTO ALEGRIA COTO

Depto. de Desarrollo Cientfico y Tecnolgico

ralegria@conacyt.gob.sv

Sala de Junta Directiva CONACYT Mircoles 9 abril 2003 2:00 p.m.

CONTENIDO:
Objetivos

Introduccin
ADN recombinante

Indicadores sobre Organismos Modific. Genticamente (OMGs)

Ejemplos de OMGs Reflexin final

OBJETIVOS:
Presentar informacin con validez cientfica, en forma clara y comprensible. Contribuir a generar un ambiente propicio para la reflexin analtica sobre la Ingeniera Gentica (Tecnologa del ADN recombinante). Promover el espritu crtico e identificar el potencial de la investigacin biotecnolgica para su aprovechamiento en beneficio del mejoramiento de la calidad de vida de los salvadoreos.

HECHOS HISTRICOS DE LA BIOLOGA MOLECULAR

1953 Watson & Crick determinacin de estructura del ADN 1966 Nirenberg, Ochoa y Khorana elucidaron Cdigo Gentico 1967 Wise y Richardson aislaron ADN ligasa 1970 Smith y Wilcox aislaron y caracterizaron Hind III 1973 Stanley Cohen y H. Boyer pusieron ADNr en bacterias 1974 Demostracin directa de deleccin gnica humana 1975 Edward Southern Southern Blotting 1977 Chow & Roberts, Sharp Intrones-Exones ADN codificante 1978 Y. W. Kan & A. M. Dozy RFPL diag. prenatal, oncogenes 1980 Maxam-Gilbert & Sanger Mtodos de Secuenciacin 1982 Tabaco, la primera planta modificada genticamente 1983 Kary Mullis concibe el PCR / Fred Sanger y colegas
publican la secuencia del fago lambda 2000 26 de junio se presenta 90% borrador genoma humano 2001 26 de enero borrador genma del arroz Oriza sativa

Transferencia de genes en animales

BIOTECNOLOGA
Cultivo de Clulas Vegetales Diagnsticos

Frmacos Anti-cncer

Solucin de crimenes Tecnologa del ADN Bancos de ADN, ARN Protenas Mapas de Genomas completos

Biologa Molecular
Ingeniera Gentica
Sntesis de Nuevas Protenas Nuevas Plantas y Animales Nuevos Alimentos Nuevos Antibiticos Clonacin Produccin de Protenas humanas Recursos humanos qumicos raros Terapia Gnica

Marcadores

Sntesis de Sondas de ADN

Localizacin desrdenes genticos

BASES MOLECULARES genoma DE LA VIDA

Clula cromosomas genes

ADN ARN

ADN

PROTENAS
los genes contienen instrucciones para hacer protenas

ADN

protenas

las protenas actan solas o en complejos para realizar las funciones celulares

Todos los seres vivos tienen su informacin hereditaria codificada en la molcula de ADN. El juego completo de ADN de un ser vivo es el genoma. El genoma humano cuenta con 3 mil millones de pares de bases (pb) y unos 30,000 genes, que son un 3% del genoma. El tamao del genoma es independiente de la complejidad del organismo. El Genoma de mayor tamao es el del pez pulmonado africano Protopterus aethiopicus con 139 mil millones de pb; una planta con flores Fritillaria assyriaca tiene 124,900 millones de pb. 60%

GENOMAS

IDENTIDAD GENTICA
70%

20%

95% idntico

De 289 genes humanos implicados en enfermedades, hay 177 cercanamente similares a los genes de Drosophila.

Humanos 30,000 genes

Chimpanc 30,000 genes

Ratn 30,000 genes

A. thaliana 25,000 genes

C. elegans 19,000 genes

D. melanogaster 13,000 genes

Entre una persona y otra el ADN solo difiere en 0.2%

COMPARACIN DE GENOMAS
ESPECIES HUMANO (Homo sapiens) RATN (Mus musculus) PEZ SOPLADOR (Fugu rubripes) MOSQUITO DE MALARIA (Anopheles gambiae) CHORRO DE MAR (Ciona intestinalis) MOSCA DE LA FRUTA (Drosophila melanogaster) LOMBRIZ INTESTINAL (Caenorhabditis elegans) BACTERIA (Escherichia coli) CROMOSOMAS GENES PARES DE BASES (MILLONES)

46 (23 pares)
40 44 6 28 8

28-35,000
22.5-30,000 ~ 31,000 ~ 14,000 ~ 16,000 ~ 14,000

~ 3,100*
~ 2,700 ~ 365 ~ 289 ~ 160 ~ 137

12
1 (cromonema)

19,000
~ 5,000

~ 97
~ 4.1
(www.jgi.doe.gov)

En humanos, aprximadamente el 3% son secuencias codificantes

ESTRUCTURA DE UN GEN
Tradicionalmente, un gen se ha definido como un segmento de ADN que codifica para un polipptido o para una molcula funcional de ARN.

Molcula de ADN

Recientemente, los nuevos descubrimientos han alterado radicalmente esta visin, para adoptar una definicin ms vaga. De acuerdo con ello, un gen es una secuencia de ADN genmico o de ARN que es esencial para especificar una determinada funcin. Para llevar a cabo su funcin el gen no necesita ser traducido a protena, y a veces ni siquiera necesita ser transcrito.

ESTRUCTURA DE UN GEN
Elementos tpicos: 1) regin reguladora o promotor basal (caja TATA). o sitios de unin de proteinas reguladoras (upstream promoter). o Realzadores (enhancers) o Silenciadores

2) sitio de inicio de transcripcin.

3) 5'UTR. 4) codn de inicio. 5) intrones y exones alternados, con sitios de procesamiento aceptores y donadores 6) Codn de paro. 7) 3'UTR.

8) seal de poli-adenilacin.

(Gomez, M. & R. Alonso-Allende, CSIC)

ESTRUCTURA GENMICA DE GENES

Regin cromosmica del gen ADAM33. (a) estructura genmica de genes a los lados de ADAM33 (barra 15 kb). (b) Estructura exon intron de ADAM33 (barra 1 kb). Polimorfismos de nucletidos nicos SNPs se indican abajo del gen. (c ) Organizacin del Dominio del gen ADAM33 y localizacin de SNPs 3UTR Codificantes. Tamao de exones en pares de bases (pb) (Kreeger, Y. The Scientist apr. 2003).

INGENIERA GENTICA O ADNr

La Ingeniera Gentica o tecnologa del ADNr se inici en la dcada de los 70s. Se refiere a un grupo de tecnologas usadas para cambiar la composicin gentica de las clulas y mover genes a travs de las fronteras de las especies para producir nuevos organismos. Se pueden aislar genes, modificarlos, introducirlos a nuevos hospederos, y clonarlos para obtener una ventaja novedosa sobre el organismo natural.

INGENIERA GENTICA: TCNICAS

DEL ADN RECOMBINANTE (ADNr)

TCNICA PROPSITO

Enzimas Restriccin
ADN Ligasa Vectores Plasmidos PCR ADNc Sondas de ADN Sntesis Gnica Gel Electroforsis

Cortan ADN en puntos especficos, hacen fragmentos de ADN

Une fragmentos de ADN Virus o fagos: llevan ADN a las clulas y aseguran replicacin Clase comn de vector Amplifica la cantidad de ADN de muestras pequeas Copia de ADN a partir de ARN mensajero Para identificar y marcar una pieza de ADN conteniendo cierta secuencia Para hacer un gen de una base de datos Para separar fragmentos de ADN

Marcadores Genticos Identifican a las clulas que han sido transformadas

Secuenciacin ADN

Para leer la secuencia de bases de un segmento de ADN

TCNICAS DEL ADNr: ENZIMAS

PARA LA MANIPULACIN DEL ADN

Enzimas de restriccin ADN polimerasas ARN polimerasas Nucleasa ADN ligasa Kinasa Fosfatasa Transcriptasa reversa

Tcnicas del ADNr: SISTEMAS

DE TRANSFERENCIA GENTICA
1. Agrobacterium. Uso de la bacteria Como "Ingeniero Gentico". La bacteria conteniendo el inserto, infecta las clulas de la planta produciendo la recombinacin gentica. 2. Acelerador de Partculas (Gene Gun). Un can artificial bombardea micropartculas con el inserto, sobre la clula. 3. Electroporacin. Uso de carga elctrica para que el ADN atraviese la membrana nuclear. 4. Polietilenglicol. Exposicin de las membranas al PEG, facilita el movimiento de las molculas de ADN. 5. Silicon Wiskers. Inyeccin con fibras microscpicas, que atraviesan las membranas con los insertos.

Tcnicas del ADNr: SISTEMAS

DE TRANSFERENCIA GENTICA
6. Microinyeccin. Una clula es adherida a una pipeta bajo un microscopio y el ADN forneo es inyectado directamente en el ncleo usando una micropipeta muy fina. Se usa cuando hay pocas clulas disponibles, tales como clulas fertilizadas de huevo animal. 7. Liposomas. Los vectores pueden ser encapsulados en pequeas vesculas de membrana para introducir el ADN in vivo en la clula.

Tcnicas del ADNr: SISTEMAS

DE TRANSFERENCIA GENTICA
En 1999 se usaron agujas de vidrio huecas con puntas de 1m de dimetro, bajo la gua de un microscopio para inyectar ADN directamente en cloroplastos. Dichas puntas finas no daan la membrana del cloroplasto, pero es requerida una alta presin para sacar el ADN de la aguja. El control del flujo de ADN bajo alta presin es un problema prctico significativo, que ha sido superado introduciendo un metal lquido en la aguja atrs del ADN. Cuando la aguja es calentada el metal se expande forzando al ADN a salir de manera controlada. Los investigadores tambin han usado esta misma tcnica para introducir ADN en bacterias individuales y ncleos de clulas eucariticas (www.ncbe.reading.ac.uk/NCBE/PROTOCOLS/DNA/PDF/DNA 01).

COMPARACIN ENTRE HIBRIDIZACIN CLSICA Y LA TRANSGNESIS

PUNTOS DE COMPARACIN Nmero de genes transferidos

HIBRIDIZACIN CLSICA
Una docena de millares de genes para encontrar el gen de inters Se limita a la compatibilidad sexual (confinada al interior de una especie)

TRANSGNESIS
Uno o varios genes de inters en una construccin gentica En principio ilimitada (franquea la barrera de las especies)

Eleccin de la caracterstica a transmitir

Tiempo para estabilizar la nueva variedad

10 a 20 aos o ms

3-4 aos

(Counseil de la science et de la technologie, 2002).

Ingeniera Gentica:
Los ANIMALES son:

MODELOS ANIMALES Y VEGETALES

Caenorhabditis elegans
(100 millones pb, 19,000 genes,

Drosophila melanogaster Mus musculus

(3 mil millones pb, 30,000 genes)

(165 millones pb)

Sus scrofa

(2 mil 700 millones pb)

pb)

Arabidopsis thaliana

Los VEGETALES son:

(100 millones

Nicotiana tabacum Orizae sativa (400 millones pb) Solanum tuberosum

Blom, N. & Rapacki K. www.dur.ac.uk/biological.sciences/Bioinformatics/dogs.htm

$ 2.1-$ 2.3 miles de millones 1999

En el ao 2000 se cultivaron en el mundo 44,2 millones de ha de PRIMERA GENERACION de cultivos transgnicos.

Plantas transgnicas Sup. cult. millones ha. % cultivos transgn. % producc. total plantas

27.8 millones de ha 1998

Soya Maiz Algodn Colza TOTAL

25,8 10,3 5,3 2,8 44,2

7%

58,4 23,3 12 6 99,7

36 16 11 7 16

NATURALEZA DE LA MODIFICACIN GENTICA

Tolerancia herbicidas Resistencia insectos Ambos

19% 74%

(Counseil de la science et de la technologie, 2002).

INDICADORES: CULTIVOS TRANSGNICOS POR

PAS EN MILLONES DE HECTAREAS, 1996 A 2000

PAS Estados Unidos Argentina Canada China Africa del Sur Australia Otros TOTAL

1999 28,7 6,7 4,0 0,3 0,1 0,1 <0,1 39,9

2000 30,3 10,0 3,0 0,5 0,2 0,2 <0,1 44,2

% de Cambio +5,6 +49,3 -25,0 +66,7 +100 +100 +10,8

(Counseil de la science et de la technologie, 2002).

INDICADORES: LIBERACIONES U.S. OMGs (17 marzo 2003)

Organismos regulados con al menos 10 liberaciones
Maz (4045)
Nmero de liberaciones APROBADAS bajo permiso y notificaciones

(desde 1987)

Papa (715) Frijol de soya (639) Algodn (591) Tomate (523) Trigo (282) Tabaco (208) Colza (173) Alfalfa (160) Arroz (142) Hierba rastrera (139) Remolacha (136) Meln (132) Lechuga (74) lamo (67) Calabaza (60) Caa de azcar (41) Fresa (40) Cebada (33) Uva (33) Manzana (32) Girasol (32) Chcharo (29) Pepino ( 25) Grama azul de Kentucky (24) Man (24) Brassica oleracea (18) Pino (17) Arabidopsis thaliana (16) Papaya (16) Petunia (16) Ocozol (16) Pseudomonas syringae (14) Zanahoria (13) Pasto San Agustn (13) Pimienta (12) Nogal (12) Pasto Bermuda (10) VMT (10) Sanda (10)

Organismos APROBADOS (categora FENOTIPOS)

Nmero TOTAL de liberaciones APROBADAS bajo permiso y notificaciones

Tolerancia a herbicidas (2864) Resistencia a insectos (2714) Calidad del producto (1772) Resistencia a virus (1196) Propiedades agronmicas (709) Resistencia a hongos (561) Otros (454) Genes marcadores (393) Resistencia a bacterias (99) Resistencia a nemtodos(10)

www.isb.vt.edu
Regulatory Information
Charts for Field Test Releases in the U.S.

CHINA ENCABEZA LA REVOLUCIN DE OMGs

La investigacin en cultivos de plantas genticamente modificadas para alimentacin, est detenida en muchas partes del mundo. En China las polticas estn promoviendo el aumento de capacidad de la Biotecnologa Vegetal. Los investigadores trabajan con ms de 50 especies de plantas, que incluyen (arroz, trigo, papas y mani) y con ms de 150 genes funcionales.

El AlgodnBt creciendo en China ha reducido el uso de pesticidas, incrementado la eficiencia de la produccin y ha mejorado la salud del agricultor (Science,295, 674 (2002).

ANIMALES ACUTICOS TRANSGNICOS

Especies
Ctenopharingodon idella carpa triploide de grama Cyprinus carpio carpa comn Carassius auratus pez dorado, goldfish Pez de Wuchang / Charr del artico / Mummychog / Walleye Pangio kuhli locha gigante / Esox lucio lucio del norte Oncorhynchus mykis trucha arcoiris, O. kisuth salmn Salmo salar salmn del Atlntico Oreochromis spp tilapia Artemia spp pulga de agua Macrobrachium rosenbergii camarn de agua dulce Penneus indicus camarn blanco Haliotis kamtschatkana abaln japones Haliothis rufescens abaln rojo Mytilus edulis almeja azul Crassostrea virginica ostra oriental Crassostrea gigas ostra del Pacfico

Transgenes
Genes marcadores Hormona de crecimiento Polipeptido anticongelamiento Cecropina Interferon Fitasa Factor VII de coagulacin humana Genes reporteros para contaminantes GnRH antisentido (liberacin Hormona Gonadotropina)

Pases
USA Canad Cuba Reino Unido Francia Noruega China Japn Corea India Israel

Hallmark, E. 2003, ISB News Report, april

Ingeniera Gentica: NUEVOS ALIMENTOS ARROZ con enzima lactoferrina de leche humana, que puede ser utilizada para mejorar las frmulas de leche infantil. Los nios la necesitan para usar eficientemente el hierro y pelear contra las infecciones
(Pearson, H. Nature, 26 april 2002).

ARROZ DORADO con beta caroteno de

genes de narciso y de Erwinia uredovora, pigmentos que se transforman en provitamina A al ser ingeridos. ARROZ fortificado con un gen de la ferritina.

ARROZ con aa esenciales (ISB, 2001, oct; Netlink, 2000).

Ingeniera Gentica NUEVAS PLANTAS

ARROZ con altos niveles de tolerancia a

diferentes condiciones ambientales de estrs. Se insertaron dos genes fusionados de trehalosa de E. Coli y un promotor tejido especfico dependiente del estrs. Los genes de trehalosa permiten la produccin de arroz an si est estresado por frio, sequa o altos niveles de salinidad e incrementa la produccin en 20%. El azcar trehalosa ayuda a estabilizar molculas biolgicas: lpidos, enzimas y otras protenas, en organismos en condiciones de estrs. La composicin qumica de los granos no cambia (PNAS Online, 27 nov. 2002).

Ingeniera Gentica: NUEVOS ALIMENTOS Salmn transgnico por

(ISB, 2001, oct; Netlink, 2000). hormona de crecimiento. Producido por AF Protein Inc. Cuenta con el promotor de la protena de anticongelamiento de otra especie de pez. Crece de 4 a 6 veces ms rpido que un salmn no transgnico. Tiene un 20% en mejoramiento de la eficiencia de conversin del alimento. VACAS LECHERAS con incremento de protenas. En Nueva Zelanda se clonaron vacas con vulos mejorados genticamente, para mejorar la produccin del queso y crema, aumentando dos veces la kappa casena, crucial para hacer la cuajada y de 20% ms de beta caseina, que mejora la accin del cuajo

(Hoag, H. Nature, 27 enero 2003).

MTODOS ANLITICOS PARA DETERMINAR TRANSGNESIS

FENOTIPO MUESTRA DURACIN SENSIBILIDAD COSTO Semilla, Plntula PROTENAS CIDO NUCLICO

Planta, subPlanta, subprod. tej. esp. prod. tej. esp. 2-3 das Muy sensible (PCR)

Das, semanas Horas, 2-3 meses das Poco sensible (manual) Barato Sensible (ELISA)

Caro, US $ 10 Muy caro, US muestra $ 200 muestra

(Rivera B., F. Huatulco 2001)

En el nuevo siglo, hay una nueva era de la C&T, nos preguntamos:

Podr El Salvador, apropiarse de los conocimientos de la Biotecnologa para resolver la necesidad de alimentar adecuadamente a su creciente poblacin?
Usaremos la Ingeniera Gentica para modificar plantas que toleren la sequa y la salinidad de las tierras o que tengan una mejor calidad alimenticia? Y

Seremos capaces de preparar los recursos humanos, que aprovechen los conocimientos derivados de la Convergencia Nanotecnolgica (Tecnologa de la Informacin, Biotecnologa, Nanotecnologa, Ciencias del Conocimiento), en beneficio del pas?

www.conacyt.gob.sv

BIENVENIDOS SUS APORTES

Atentamente: ROBERTO ALEGRIA ralegria@conacyt.gob.sv