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El ADN es la sustancia qumica donde se almacenan las instrucciones que dirigen el desarrollo de un ser humano, que mantienen su funcionamiento y que permite la herencia. Es una molcula de longitud gigantesca, que est formada por agregacin de tres tipos de sustancias: azcares, llamados desoxirribosas, el cido fosfrico, y bases nitrogenadas de cuatro tipos, la adenina, la guanina, la timina y la citosina. Los azcares y los cidos fosfricos se unen lineal y alternativamente, formando dos largas cadenas que se enrollan en hlice. Las bases nitrogenadas se encuentran en el interior de esta doble hlice y forman una estructura similar a los peldaos de una escalera. Se unen a las cadenas mediante un enlace con los azcares. Cada peldao est formado por la unin de dos bases (slo pueden darse entre la adenina y la timina o entre la citosina y la guanina). Las secuencias (el orden) a lo largo de la cadena de ADN es lo que determina las instrucciones biolgicas que contiene.
en humanos), contienen ADN en sus ncleos celulares. (tambin podemos encontrar ADN, en las mitocondrias y los cloroplastos). La cantidad de ADN presente en algunos tejidos es muy pequea; por este motivo no representa una fuente conveniente de extraccin, aislamiento y purificacin, para ser empleado en diferentes estudios de carcter gentico, biolgico. y/o bioqumico.
Algunas Utilidades
Seleccin de ADN
Para seleccionar un tejido como fuente de ADN debe reunir dos condiciones: Contener gran cantidad de material gentico Poseer baja actividad de DNAasa (desoxirribonucleasa )
Proceso
Macro mtodos (<1ml Gustincich y Cols) micro mtodos (>5ml Miller Cols)
La extraccin de ADN requiere una serie de etapas bsicas: En primer lugar: tiene que romperse la pared celular y la membrana plasmtica para poder acceder al ncleo de la clula. A continuacin debe romperse tambin la membrana nuclear para dejar libre el ADN. DETERGENTES Los jabones utilizados como lavavajillas emulsionan los lpidos de las membranas celulares y las rompen. 1.- La sal evita la unin de las protenas al ADN. 2.- Para aislar el ADN hay que hacer que precipite en alcohol. SOLVENTES ORGANICOS ( El ADN es soluble en agua, pero cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y se logra la PRECIPITACION en la interfase entre el alcohol y el agua.) Adems de permitirnos ver el ADN, el alcohol separa el ADN de otros componentes celulares, los cuales son dejados en la solucin acuosa.
La extraccin de ADN
Pasos en general:
1. 2. 3. 4.
Adquirir la muestra de Clulas Tronar las clulas para liberar el ADN Separar el ADN de protenas y desechos Aislar ADN concentrado
Material
REACTIVOS Agua bidestilada Buffer CTAB Buffer de lisis (DTAB) Buffer tris- EDTA (TE) Cloroformo Etanol al 100% y 70% NaCl 1.2M MATERIAL Y EQUIPO
Gradillas para microtubos Microcentrifuga Micropipeta de volumen variable Microtubos de 1.5 y 2 Puntas desechables para pipeta Termoback mL
Procedimiento
Colocar alrededor de 300ml de sangre completa (Con EDTA) en un microtubo de 2ml y agregar 600ml de buffer de lisis e incubar a 68C durante 5 minutos
Procedimiento
Despus de la incubacin agregar 900ml de cloroformo al 100% agitar vigorosamente durante 5 min (sin usar bortex), y centrifugar a 10,000rpm por 10 min
Procedimiento
Recuperar cuidadosamente la fase acuosa y transferirla a un microtubo de 1.5ml estril Adicionar 100ml de Buffer CTAB y 900ml de agua destilada, agitar suavemente por 2min y centrifugar a 100,000 rpm durante 10 min
Procedimiento
Decantar el sobrenadante y re suspender la pastilla de ADN en 300 ml de NaCl 1.2M y 750ml de etanol al 100% frio y mezclar suavemente por inversin. Centrifugar a 10,000 rpm por 10 min
Procedimiento
Repetir el paso anterior al menos 2 veces. Decantar el sobrenadante y secar la pastilla de ADN hasta que el etanol se evapore completamente
Procedimiento
Re suspender la pastilla de ADN en 100ml de buffer TE e incubar a 55C por 5min.
Procedimiento
Resuspender la pastilla de ADN en 100ml de buffer TE e incubar a 55C por 5min. Almacenar a 4C.