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Introduccion

El ADN es la sustancia qumica donde se almacenan las instrucciones que dirigen el desarrollo de un ser humano, que mantienen su funcionamiento y que permite la herencia. Es una molcula de longitud gigantesca, que est formada por agregacin de tres tipos de sustancias: azcares, llamados desoxirribosas, el cido fosfrico, y bases nitrogenadas de cuatro tipos, la adenina, la guanina, la timina y la citosina. Los azcares y los cidos fosfricos se unen lineal y alternativamente, formando dos largas cadenas que se enrollan en hlice. Las bases nitrogenadas se encuentran en el interior de esta doble hlice y forman una estructura similar a los peldaos de una escalera. Se unen a las cadenas mediante un enlace con los azcares. Cada peldao est formado por la unin de dos bases (slo pueden darse entre la adenina y la timina o entre la citosina y la guanina). Las secuencias (el orden) a lo largo de la cadena de ADN es lo que determina las instrucciones biolgicas que contiene.

La extraccin del ADN


La extraccin de ADN consiste en la separacin de este material de las Clulas que lo contienen, todas las clulas, (a excepcin de las clulas anucleadas de los eritrocitos maduros

en humanos), contienen ADN en sus ncleos celulares. (tambin podemos encontrar ADN, en las mitocondrias y los cloroplastos). La cantidad de ADN presente en algunos tejidos es muy pequea; por este motivo no representa una fuente conveniente de extraccin, aislamiento y purificacin, para ser empleado en diferentes estudios de carcter gentico, biolgico. y/o bioqumico.

Algunas Utilidades

Seleccin de ADN
Para seleccionar un tejido como fuente de ADN debe reunir dos condiciones: Contener gran cantidad de material gentico Poseer baja actividad de DNAasa (desoxirribonucleasa )

Proceso
Macro mtodos (<1ml Gustincich y Cols) micro mtodos (>5ml Miller Cols)
La extraccin de ADN requiere una serie de etapas bsicas: En primer lugar: tiene que romperse la pared celular y la membrana plasmtica para poder acceder al ncleo de la clula. A continuacin debe romperse tambin la membrana nuclear para dejar libre el ADN. DETERGENTES Los jabones utilizados como lavavajillas emulsionan los lpidos de las membranas celulares y las rompen. 1.- La sal evita la unin de las protenas al ADN. 2.- Para aislar el ADN hay que hacer que precipite en alcohol. SOLVENTES ORGANICOS ( El ADN es soluble en agua, pero cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y se logra la PRECIPITACION en la interfase entre el alcohol y el agua.) Adems de permitirnos ver el ADN, el alcohol separa el ADN de otros componentes celulares, los cuales son dejados en la solucin acuosa.

La extraccin de ADN
Pasos en general:

1. 2. 3. 4.

Adquirir la muestra de Clulas Tronar las clulas para liberar el ADN Separar el ADN de protenas y desechos Aislar ADN concentrado

Material
REACTIVOS Agua bidestilada Buffer CTAB Buffer de lisis (DTAB) Buffer tris- EDTA (TE) Cloroformo Etanol al 100% y 70% NaCl 1.2M MATERIAL Y EQUIPO

Gradillas para microtubos Microcentrifuga Micropipeta de volumen variable Microtubos de 1.5 y 2 Puntas desechables para pipeta Termoback mL

Procedimiento
Colocar alrededor de 300ml de sangre completa (Con EDTA) en un microtubo de 2ml y agregar 600ml de buffer de lisis e incubar a 68C durante 5 minutos

Lisis .Detergente .Proteinasa K

Procedimiento
Despus de la incubacin agregar 900ml de cloroformo al 100% agitar vigorosamente durante 5 min (sin usar bortex), y centrifugar a 10,000rpm por 10 min

Procedimiento
Recuperar cuidadosamente la fase acuosa y transferirla a un microtubo de 1.5ml estril Adicionar 100ml de Buffer CTAB y 900ml de agua destilada, agitar suavemente por 2min y centrifugar a 100,000 rpm durante 10 min

Procedimiento
Decantar el sobrenadante y re suspender la pastilla de ADN en 300 ml de NaCl 1.2M y 750ml de etanol al 100% frio y mezclar suavemente por inversin. Centrifugar a 10,000 rpm por 10 min

Procedimiento
Repetir el paso anterior al menos 2 veces. Decantar el sobrenadante y secar la pastilla de ADN hasta que el etanol se evapore completamente

Procedimiento
Re suspender la pastilla de ADN en 100ml de buffer TE e incubar a 55C por 5min.

Procedimiento
Resuspender la pastilla de ADN en 100ml de buffer TE e incubar a 55C por 5min. Almacenar a 4C.

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