IDENTIFICAREA PRIN CARACTERISTICILE ADN

Metoda se bazeaz pe compararea probelor de esut sau snge recoltate de la cadavru i de la

AMPRENTA AND
persoana n via

ADN formeaz materialul genetic i conine 2 lanuri de nucleotide spiralate ntr-un dublu helix (adenin, guanin, timin, citozin); Genele sunt formate din segmente care conin sute sau mii de legturi, segmente separate prin zone de material ADN care nu ndeplinesc funcie genetic, numite ADN redundant; n fiecare nucleu de celul uman exist aproximativ o molecul de ADN, dar numai 10% este utilizat pentru codificarea genetic, restul fiind ADN redundant; Pe aceste segmente silenioase exist circa 200-14000 de secvene repetitive de ADN; S-a constatat c segmentele redundante adiacente variaz foarte mult n componena bazelor, dar sunt foarte constante pentru un anumit individ i se transmit dup anumite reguli, cu alte cuvinte, formeaz o semntur care este virtual unic pentru fiecare individ cu excepia gemenilor monozigoi; anse ca dou persoane s aib aceeai secven sunt de aproximativ 1 la un bilion de milioane; Pentru a identifica un segment redundant numit frecvent minisatelit sau regiunea hipervariabil este necesar material nuclear uman; este suficient un volum mic de snge cu leucocite, sau o prob de sperm, fragment dentar, pr cu puine celule epiteliale; Rezultatul obinut const ntr-o serie de benzi paralele, iar tehnica de comparare i identificare const n identificarea anumitor benzi n poziii date; nu are valoare dac nu exist prob de comparat; ADN este fragmentat de enzimele de restricie (endonucleoz) care taie lanul ADN n anumite zone fragmentele sunt separate prin migrare electroforetic n gel; n cazul esuturilor descompuse, identificarea ADN este mai slab dect la persoanele vii; dac nu exist mduv osoas, cel mai bun material este splina.

ISTORICUL AMPRENTEI ADN

1944 Oswald Avery a definit rolul componentei celulare numite ADNacid dezoxiribonucleic ca vehicol al transmiterii caracterelor genetice. 1953 James Watson i Francis Crick au elucidat structura dublu helicoidal a moleculei de ADN. n tiin la fel ca i n art, forma este adaptat funciei, structura acestei molecule unice fiind o explicaie a proprietilor sale unice, i n special a transmiterii sale din generaie n generaie. 1980 David Botstein i colaboratorii au fost primii care au exploatat variaiile mici dintre diferite grupe populaionale la nivel genetic ca markeri de reconstrucie a hrilor genetice. 1984, n timpul cercetrilor sale de identificare a markerilor de boal n structura ADN, Alec Jeffreys a descoperit o aplicaie unic a tehnologiei RFLP n identificarea personal. Aceast metod, pe care a numit-o amprenta ADN a fost modificat i adoptat de laboratoarele de criminalistic de pretutindeni. Oamenii de tiin prefer ca denumire a acestei metode tipare ADN sau profil ADN. 1986 Kary Mullis imagineaz PCR-polymerase chain reaction, pentru care primete i Premiul Nobel n chimie, reacie ce a schimbat faa biologiei moleculare. RFLP i PCR sunt elementele cheie n tiparea ADN.

IMPORTANA ADN

Datorit eforturilor incluse sub denumirea generic de human genome project toate informaiile coninute n codul genetic uman au fost descifrate i catalogate. Aceasta a dus la identificarea genelor implicate n declanarea anumitor afeciuni cum ar fi boala Huntington, fibroza chistic, distrofia muscular i diferitele forme de cancer genetic determinate. Diagnosticele precoce i fidele precum i terapiile medicamentoase aplicate n timp util au fcut posibil aplicarea transplantelor genice n anumite trialuri clinice pentru aceste tipuri de afeciuni. Emigraia i stabilirea paternitii au fost alte cmpuri largi de utilizare a tiprii ADN. Cunoaterea modalitii de transmitere a ADN n familie poate oferi informaii valoroase privind identitatea persoanelor disprute. Resturile biologice pot fi identificate ca avnd anumite ascendene familiale pe baza determinrii probabilitii celei mai apropiate relaii genetice ntre membrii unei familii i cel decedat. De asemenea copii avortai sau omori pot fi identificai ca aparinnd anumitor familii pe baza corespondenei ADN. Cu ajutorul tiprii ADN se pot identifica victimele de rzboi, victimele unor dezastre, sau diferiii agresori. Datorit stabilitii sale relative comparativ cu alte molecule biologice, ADN, i ndeosebi anumite tipuri particulare de ADN, cum ar fi ADN mitocondrial, a devenit un mijloc important utilizat n studiul antropologiei i a istoriei vechi. De exemplu, n studierea rmielor lui Cristofor Columb, a mumiilor vechi egiptene, n elucidarea anumitor probleme legate de familia ultimului ar al Rusiei, i nu n ultimul rnd n datarea scheletelor de dinozauri. Actualmente ADN este o metod deosebit de util n investigarea diferitelor tipuri de crime, excluderea suspecilor pe baza analizei ADN fiind absolut, fr suspiciuni de probabilitate statistic.

AND IN MEDICINA LEGALA

Identificarea suspecilor pe baza probelor biologice recoltate de la locul faptei; Disculparea suspecilor nevinovai; Eliberarea celor inculpai nevinovai; Stabilirea filiaiei pe linie patern sau matern; Identificarea rmielor umane n urma unor descoperiri arheologice, sau n urma unor atentate, catastrofe, sau dezastre; Stabilirea relaiilor de descenden biologic cu aplicabilitate n antropologie. La ora actual, nu exist n legislaia romn reglementri cu privire la acceptana testului ADN ca prob n instan, spre deosebire de legislaia altor ri cum ar fi SUA sau Anglia.

Bazele tiinifice ale amprentrii ADN

Este un fapt acceptat c ADN este un marker individual, cu excepia gemenilor monozigoi, constituind materialul genetic care conine ntreaga informaie necesar dezvoltrii i funcionrii normale a organismului. Aproximativ 99,5% din codarea ADN este identic pentru ntreaga populaie, doar 0,5% din populaie fiind relevant pentru lumea tiinific. Aceast proporie explic variabilitatea tipologiei umane i unicitatea trsturilor cum ar fi culoarea prului, forma i culoarea ochilor, caracteristicile celulelor sangvine. Unele diferene n caracteristicile fizice ale persoanelor nu sunt vizibile i de aceea trebuie investigate prin tehnici speciale de laborator.

Genetica este tiina care se ocup cu studiul ereditii i a varietii organismelor biologice. Pe plan individual se ocup cu modalitatea de transmitere a caracterelor particulare de la prini la copii, iar pe plan global, studiaz modalitatea de transmitere a markerilor genetici n populaie, ambele concepte fiind eseniale n investigarea medicolegal pe baza analizei ADN.

Noiuni de genetic uman

cea mai mic unitate structural i funcional a organismelor vii o constituie celula. Fiecare celul uman are un diametru de aproximativ 1/10 din diametrul firului de pr, iar corpul uman conine aproximativ 3 trilioane de celule. Majoritatea celulelor (excepia major fiind eritrocitele) conin o entitate central numit nucleu, centru organizaional celular .

Informaia genetic este coninut n nucleu i organizat n 2 structuri fizice numite cromozomi. Cromozomii se transmit ca uniti intacte de la prini la copii, distribuirea lor fiind egal ntre cele 2 celule fiice n cursul diviziunii celulare. Fiecare cromozom este alctuit din o molecul lung de ADN, asociat cu proteine numite histone.

Fiecare celul uman conine 23 perechi de cromozomi. Fiecare persoan are 2 exemplare din fiecare cromozom: unul de la tat i unul de la mam.

Noiuni de genetic uman

Numrul i forma cromozomilor sunt aceleai pentru indivizii unei specii i alctuiesc cariotipul.

Aspectul cariotipului uman

Genele sunt segmente scurte de ADN ce condiioneaz sinteza uneia sau mai multor proteine, deci manifestarea i transmiterea unui caracter ereditar determinant. Genele sunt situate n locuri bine determinate ale cromozomilor care se numesc loci, plasament care se pstreaz de la o generaie la alta. Forme diferite ale aceleai gene sau marker poart numele de alele; fiecare din cele dou alele sunt motenite de la prini. Cel mai simplu exemplu de gene alele a fost observat de Gregor Mendel n 1866, printele geneticii moderne. Un exemplu tipic de alele n cadrul aceleiai gene umane l constituie sistemul sangvin ABO. Dac locaia particular a alelor n genom este aceeai pe fiecare cromozom (locus) situaia se numete heterozigot.

Noiuni de genetic uman

Celulele sexuale sunt numite gamei i posed un singur exemplar din fiecare cromozom, n timp ce toate celelalte celule ale organismului, numite celule somatice posed dou exemplare ale aceluiai cromozom. Aceti cromozomi ai celulelor sexuale sunt numii X sau Y: brbaii au un cromozom X i unul Y, iar femeile au 2 cromozomi X. Ovule conin doar cromozomi X n timp ce celulele spermatice pot conin cromozomi de ambele tipuri, X sau Y. Sexul este determinat de componenta paternal. Informaia coninut de cromozomii sexuali este diferit att ca structur ct i ca aspect, sexul putnd fi determinat prin testare ADN.

Noiuni de genetic uman

Genomul uman constituie totalitatea informaiei genetice i este localizat n cromozomi, fiind dat de totalitatea perechilor de baze ce compun moleculele de ADN. ntregul genom uman conine 46 de cromozomi cte 23 de la fiecare printe, fiecare cromozom coninnd sute sau mii de gene.

Noiuni de genetic uman

Markerii ADN reprezint gene sau fragmente de ADN a cror localizare n genom este cunoscut. Haplogrupul este format dintr-o colecie de haplotipuri strns nrudite. Haploidismul definete coninutul genetic motenit de la un printe i este format din 23 de cromozomi. Profilul ADN se definete ca fiind totalitatea acelor caracteristici structurale ale materialului genetic care permit recunoaterea sau identificarea unui individ.

Tat cu gen anormal pe un cromozom autozomal

Mam avnd cromozom autozomal normal

Prini

Copii Fig.30.Fiecare sarcin are 50% anse de a purta o gen anormal

Fiecare sarcin are 50% anse de a purta o gen anormal

Noiuni de biologie molecular

n natur, ADN are o form dublu elicoidal, fiecare helix fiind format dintr-o secven de nucleotide, cele 2 lanuri de nucleotide fiind legate prin bazele azotate care sunt complementare, adic adenina se leag ntotdeauna cu timina, iar guanina cu citozina.

RFLP Restriction Fragment Lenght Polymorphism Prima tehnic adaptat analizei ADN n scop medico-legal poart numele de RFLP Restriction Fragment Lenght Polymorphism, metod care determin variaia n lungime a unui segment dat de ADN. Metoda ofer un grad nalt de discriminare pentru determinarea fiecrui locus. Dac dou mostre provin din surse diferite, metoda de elecie utilizat n discriminarea lor este RFLP. PCR Polymerase Chain Reaction PCR constituie o tehnic ce presupune amplificarea specific a regiunilor hipervariabile de ADN, astfel nct de la o cantitate foarte mic de ADN se ajunge la o cantitate corespunztoare pentru genotipare, proces numit amplificare ADN. Procedeul a fost att de inovator nct inventatorul su a primit n 1993 premiul Nobel. Adesea metoda este numit xeroxare ADN, deoarece se copie doar un fragment minim de ADN cu extrem fidelitate comparativ cu fragmentul iniial.

Tehnici de amprentare ADN

AD N La sud Proba P Origine homozig ot homozig heterozig ot ot AD N Proba P Legare la locusul D

Inferen Mam Crossover copil nr. 8 Tat

Interpretarea i evaluarea rezultatelor ADN

1. excluzia. mostrele sunt diferite, deci provin de la indivizi diferii. Concluzia este absolut i nu implic analize sau excluzia. discuii ulterioare. 2. inconcluzia. rezultatul este inconclusiv, adic nu se poate stabili cu certitudine similaritatea celor dou tipuri de ADN. inconcluzia. Aceast posibilitate deriv dintr-o multitudine de factori cum ar fi: degradarea, contaminarea sau nerespectarea anumitor etape ale protocolului tehnic. Anumite etape ale analizei trebuie repetate folosind aceleai mostre sau mostre diferite, n ncercarea de a obine un rspuns concluziv. Este ca i cum analiza ADN nu ar fi fost efectuat. 3. similitudinea. Mostrele sunt identice, conin acelai ADN, deci aparin aceluiai individ. n acest caz se ridic similitudinea. ntrebarea: care este semnificaia acestei similitudini. Determinarea similaritii const din punct de vedere tiinific n obinerea unei concluzii de similaritate genetic sau concordan genetic. Pentru evaluarea acesteia trebuie cunoscut tipul de marker utilizat, sistemele de tipare fiind mprite n sisteme care detecteaz sisteme alelice continue (RFLP) i sisteme alelice discrete (PCR). Evaluarea rezultatelor Mostrele prezint similariti genetice n trei circumstane: mostrele provin din aceeai surs ceea ce nseamn c proba analizat (snge, saliv, sperm) provine de la aceeai persoan care a furnizat mostra de referin. similaritatea este o coinciden ceea ce nseamn c proba provine de la alt persoan dect cea care a dat mostra de referin, cele dou persoane avnd acelai profil genetic. similaritatea este un accident (eroare) mostrele provin de la persoane diferite, dar n cursul analizei au aprut artefacte, erori de tehnic, etc. Att anchetatorii, ct i victimele sau agresorii doresc s afle care din aceste posibiliti este cea adevrat. Pentru aceasta trebuie trecut la pasul urmtor. Calcularea estimativ a probabilitii Evaluarea testelor genetice se face cu ajutorul termenilor de probabilitate cu ajutorul teoremei lui Bayes, conform creia posibilitatea ca dou evenimente necondiionate s se produc simultan este egal cu produsul celor dou probabiliti considerate independent. Astfel dac avem 2 evenimente A i B considerate independente, posibilitatea ca ele s se produc simultan este: P(A,B)=P(A) xP(B) Probabilitatea de producere simultan se numete raport de probabilitate condiionat, numit n literatur likehoodratio (LR). n funcie de valorile acestui indice, probabilitatea condiionat este cuprins ntre 100 i 1000 i poate avea valoare foarte nalt pentru valori mai mari de 1000. Substructura populaional

Raportul de expertiz medico-legal ADN admis n instan trebuie s conin urmtoarele date: Copii ale autoradiogramei sau electroforetogramei; Cartea tehnic a laboratorului; Rapoarte ale testelor de control a calitii materialelor utilizate n laborator; Raport al laboratorului asupra metodelor folosite pentru declararea potrivirii sau nepotrivirii (deviaii standard incluse); Declaraie privind metoda folosit pentru calcularea frecvenelor alelelor n populaia local; Certificarea primit de laborator care s ateste c s-au folosit aceleai metode att pentru determinarea frecvenelor alelelor ct i pentru o identificare a unui suspect anterior acestui caz; Dac proba este degradat acest lucru trebuie notat n raport: Includerea n raport a altor defecte, contaminarea n timpul procesrii dac a avut loc, erori de laborator care pot modifica rezultatele; Criteriile de potrivire (identificarea probei necunoscute ca fiind a suspectului); Documentele de nsoire a probelor; Prezentarea statistic a bazei de date locale ale laboratorului.

Expertiza medico-legal ADN

Expert n genotiparea ADN uman

Pentru a dobndi calitatea de expert n genotiparea ADN uman trebuie: S fie absolvent al unei instituii de invmnt superior n domeniul medical; S urmeze cursuri de specializare n domeniul tiinelor juridice; S participe la activitatea de experimentare-predare n domeniu; S aib stagiu de pregtire ntr-un laborator de profil; S aib activitate tiinific n domeniu; S susin examen de primire a licenei profesionale care s-i ateste calitatea de expert.

Expertul legist n medicina legal: Trebuie s fac o investigaie complet i corect; S aib o atitudine de independen, imparialitate, obiectivitate; S elaboreze un raport care s nu conin fapte, opinii personale, despre vinovia/nevinovia inculpatului; S-i susin depoziia n termeni unanim acceptai de comunitatea tiinific; S se pun la dispoziia aprrii i n absena cererii judectorului; s fie capabil s rspund ntrebrilor jurailor privind tehnica genetic folosit pentru testarea ADN.

Do the Clouds of Consciousness